新型细胞核靶向非病毒基因载体的研究

发布时间：2019-01-24 21:35

【摘要】：随着生物技术与分子生物学的发展,以及人类基因组计划的完成,基因治疗已经成为遗传病、传染病、癌症等重大疾病的一种新兴治疗方法。有效地基因治疗需要高效的传递载体。非病毒基因载体具有无免疫源性、低毒、廉价的优点,但是相比于病毒载体,其转染效率低,限制了其临床应用。非病毒载体的基因传递有三个主要屏障：细胞膜、内吞体膜、细胞核。本课题将糖皮质激素(GC)与阳离子聚合物连接,合成新型GC-聚阳离子化合物,以糖皮质激素作为核定位信号(NLS),增加载体的细胞核靶向作用,提高转染效率。利用糖皮质激素的脂溶性,用GC-聚阳离子修饰脂质体,得到新型的聚阳离子脂质体。同时用特异性细胞配体修饰脂质体,使其具有细胞特异性靶向和细胞核靶向的双重作用。课题首先选择5种具有21-羟基的糖皮质激素,将21-羟基用甲磺酰基取代,再用Traut's试剂(2-iminothiolane)将其与低分子量聚乙烯亚胺(PEI 1800)接枝,合成糖皮质激素-聚阳离子(GC-PEI),用1H-NMR和红外光谱验证GC与PEI的结合。采用琼脂糖凝胶电泳、动态光散射、透射电镜研究了它们与pDNA结合后粒子(polyplex)的理化性质,MTT法检测其细胞毒性,用pEGFP-N1和pGL-3质粒评价了其在HEK 293和HepG 2细胞系中的转染效率。将新型材料用异硫氰酸荧光素标记,激光共聚焦显微镜观察其细胞内定位。结果表明,5种polyplex的理化性质差别不大,细胞毒性明显低于PEI 25k,转染效率的高低顺序为：倍他米松-PEI地塞米松-PEI甲基强的松龙-PEI泼尼松龙-PEI氢化可的松-PEI,表明新型GC-PEI的转基因活性与取代的GC活性为正比关系,GC的活性越高,与受体结合的能力越强,则转染活性越高。选取活性更强的曲安奈德(TA),与PAMAM (G4)接枝合成PAMAM-TA以提高其转染效率,降低毒性。为检验TA取代度的影响,合成高、低取代度的PAMAM聚合物(PAMAM-TA-H的PAMAM-TA-L).研究表明,它们的理化性质相似。MTT检测表明其毒性显著低于PAMAM与PEI 25K。细胞内定位研究表明PAMAM定位于细胞质,而PAMAM-TA-H和PAMAM-TA-L均定位于细胞核。这表明将TA接枝PAMAM会促进其细胞核定位,从而提高转染效率。TA取代度低至0.22不会影响其细胞核定位能力。此外,将TA与不同分子量的PEI连接(Mw 600,1800,25k),对其理化性质、细胞毒性、转染效率和细胞内定位进行了研究。结果表明,所得三种PEI-TA的理化性质相似,毒性明显低于PEI 25k,转染效率大小顺序为PEI1800-TA PEI 600-TA PEI 25K-TA。用TA抑制转染试验表明,TA会显著抑制PEI 1800-TA和PEI 600-TA的转染效率,对PEI 25K-TA无影响,说明PEI1800-TA和PEI 600-TA会进入细胞核而提高转染效率,因此TA与受体结合后会抑制其转染效率,PEI 25K-TA不会进入细胞核,因此不受TA影响。激光共聚焦显微镜观察的结果证实了这一点。动物实验表明,小鼠肝门静脉注射后,PEI 1800-TA和PEI 25k/pEGFP在肝脏中有较强的转基因表达,而PEI 1800-TA显著高于PEI 25k,这与体外实验结果一致,而在其它脏器中无表达。最后,本文将PEI 1800-TA与脂质体结合,制备聚阳离子脂质体,再用带有半乳糖苷基团的[(2-乳糖酰胺基)乙胺基]甲酸胆固醇酯(CHEDLA)修饰脂质体,制备成连续靶向基因载体(STL),使其具有细胞核靶向和细胞特异性靶向功能,期望能够有效突破各种障碍,实现高效的基因传递。通过理化性质研究,表明PEI-TA成功修饰了脂质体,STL为纳米结构,表面带正电荷,能够有效压缩pDNA。STL的细胞毒性低于PEI-TA,而转染效率高于后者。STL的组成中磷脂与PEI-TA的摩尔比为6：4,含有10%　CHEDLA时,转染效率最优。加入游离的半乳糖能够显著抑制STL的转染,证明其肝细胞特异靶向性。体内研究表明,肝门静脉注射后,10%　CHEDLA STL的肝脏表达显著高于0%CHEDLA STL、PEI 1800-TA和PEI 25K,而在其它脏器无表达。表明所构建的STL载体能够有效的传递基因物质至靶器官,实现较高的转染效率。综上所述,本文达到了课题的研究目标,是构建多功能非病毒基因载体的有效方法。
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【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R346

【参考文献】