肠出血型大肠埃希菌O157:H7 EspF蛋白诱导细胞凋亡功能研究

发布时间：2019-01-28 07:48

【摘要】：一、研究背景和目的肠出血型大肠埃希菌(Enterohaemorrhagic Escherichia coli, EHEC)0157：H7是一种新现肠道传染病致病菌,能引起出血性结肠炎(Hemorrhagic colitis, HC)、溶血性尿毒综合征(Hemolytic uremic syndrome, HUS)和血栓性血小板减少性紫癜(Thrombotic thromobocytopenie porpura, TTP)等。1983年,Riley等首次报道了美国EHEC0157：H7引起的严重食源性疾病——出血性结肠炎。此后,由EHEC0157：H7引起的散发病例和小型暴发在世界范围内不断发生。1986年,我国首次从出血性结肠炎患者中分离到EHEC0157：H7,已有十余个省份从食品、家畜家禽和腹泻患者粪便中分离到该菌。目前,EHEC0157：H7的感染呈暴发流行趋势,具有较强的传染性与致病性,对人类健康构成极大威胁,已成为全球性的公共卫生问题。 EHEC O157:H7的致病作用主要通过产：生志贺样毒素(STX)和细菌对肠黏膜上皮细胞黏附-抹去损伤(attaching and effacing lesion, A/E损伤)完成。0157：H7能产生致死性志贺毒素(Stx),由前噬菌体上的slt基因编码,是产Vero毒素大肠埃希菌(Vcrocytotoxin-producing E.coli,VTEC)区别于其它大肠杆菌的显著特点。引起A/E损伤的主要毒力基因位于染色体肠细胞脱落位点(the locus of enterocyte effacement, LEE)毒力岛。LEE毒力岛由5个操纵子组成,编码111型分泌系统(TTSS)、转位蛋白(EspA, EspB, and EspD)、效应蛋白(Tir, EspG, EspF, Map和lEspH)、紧密黏附素(intimin)、分子伴侣(CesAB, CesD, CesD2, CesF和CesT)和调控子(Ler, GrlA和GrlR)等。espF基因位于LEE4操纵子末端,编码分泌效应蛋白EspF (EHEC-secreted protein F)。目前,EHEC O157:H7感染致病的效应蛋白已增加到20多种,其中EspF的作用范围最广,是多功能性的。肠致病型大肠埃希菌(Enteropathogenic E.coli, EPEC)的有关研究表明,EspF可与线粒体、核仁及细胞内众多蛋白分子结合,导致上皮细胞紧密连接破坏、微绒毛消失、细胞骨架重排、垫状结构(pedestal)形成,最终导致细胞凋亡。学术界认为,分泌蛋白EspF对于研究A/E病原体致病作用的分子机制举足轻重,甚至将其称为细菌性病原体致病的“瑞士军刀”。虽然,不同实验室对EPEC中EspF蛋白在细胞特异性A/E损伤中的作用进行了深入研究,但是EHEC中EspF蛋白诱导宿主细胞凋亡的机制仍然不甚清楚,破坏肠上皮细胞紧密连接导致肠屏障功能丧失的动力学机制也不清楚。那么EHEC0157：H7中,EspF蛋白是否具有破坏细胞屏障功能,诱导细胞凋亡呢?EHEC0157：H7侵袭黏附宿主上皮细胞后是否影响肠上皮细胞紧密连接,导致肠粘膜改变或脱落而导致细胞黏附-抹去损伤?EspF蛋白哪个功能域在起作用呢? 本实验的前期研究中,我们选取espF基因N端48-204bp序列作为敲除对象,采用重叠延伸PCR(OL-PCR)和同源重组技术,成功构建了espF基因N端缺失突变株EHEC O157:H7(ΔespF)。细菌黏附实验和细胞毒性实验表明,espF基因的缺失减弱了细菌对细胞的黏附能力和细胞毒性作用,但不影响细菌的生物学特性。本研究拟在已构建的ΔespF突变株的基础上,利用EHEC O157:H7野生型菌株和ΔespF突变株分别感染结肠癌Lovo细胞和BALB/c小鼠,采用免疫印迹法检测感染细胞的Caspase家族凋亡蛋白酶-9/-3活性,采用TUNEL试验法检测体外感染细胞凋亡情况,比较EHEC野生型菌株和突变株感染后小鼠死亡率、结肠形态、结肠重量和结肠黏附细菌数量,荧光显微镜观察结肠粘膜改变和细菌黏附情况。从蛋白分子、细胞水平和动物感染模型着手,揭示EspF蛋白在EHEC0157：H7导致肠上皮细胞黏附-抹去损伤过程中的细胞凋亡作用。此外,本研究还采用PCR鉴定技术、细菌黏附性实验和细胞LDH释放实验,对本实验室收集的18株EHEC O157:H7流行菌株进行毒力鉴定,为后续EHEC致病机制研究筛选毒力菌株提供理论依据。二、研究方法 1. EHEC O157:H7EspF蛋白导致细胞凋亡的研究 (1) Lovo细胞中Caspase-9/3凋亡蛋白检测根据Western Blot实验步骤,用EHEC O157:H7野生型菌株(WT)、espF基因缺失突变菌株(ΔespF)和放线菌素D(Act-D)分别处理Lovo细胞3h,激活Caspase家族蛋白酶-9/-3的活性。细胞裂解后提取蛋白,SDS-PAGE分离目的蛋白、转膜、封闭,用Caspase-9抗体和Caspase-3抗体孵育过夜,HRP标记的二抗孵育,ECL化学发光底物显色,凝胶成像仪检测细胞凋亡蛋白分泌情况。同时设置空白对照组,选择微管蛋白Tubulin作为内参对照,调节各组样本量。 (2) TUNEL细胞凋亡检测EHEC O157:H7WT、ΔespF菌株和Act-D分别处理Lovo细胞3h,并设置空白对照组。PBS漂洗,样品经固定、封闭、通透后,TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒染色,DAPI复染,荧光显微镜下观察细胞凋亡情况并计数TUNEL阳性细胞数。 (3)EHEC感染小鼠导致结肠A/E损伤的研究EHEC O157:H7WT、ΔespF和LB培养基分别灌胃接种BALB/c小鼠。第一批实验小鼠感染后饲养20天,观察小鼠生长和存活情况。另一批实验小鼠于感染第七天处死,观察结肠形态、水肿等病理特征,称量结肠重量,涂板计数结肠黏附细菌数量。结肠经4%多聚甲醛固定、30%蔗糖溶液脱水后制作冰冻切片,切片经固定、通透后,用抗EHEC0157：H7抗体和罗丹明-鬼笔环肽进行染色,荧光显微镜下观察结肠粘膜损伤和细菌黏附情况。 2. EHEC O157:H7流行菌株的毒力鉴定根据E-hlyA,stx2,stxl基因序列设计引物,PCR检测不同地区发生EHEC0157：H7暴发流行菌株的毒力基因；不同菌株感染Vero细胞3h,Giemsa染色观察细菌对Vero细胞的黏附性；GENMED乳酸脱氢酶(L-lactate dehydrogenase,LDH)检测试剂盒检测不同细菌作用细胞后释放的LDH,通过计算LDH释放率,比较不同菌株的细胞毒性作用强弱。 3.统计分析方法数据统计分析利用SPSS13.0软件,检验水准为α=0.05,P0.05认为差异有统计学意义。TUNEL阳性细胞计数和结肠重量采用单向方差分析(One-Way ANOVA),各组均数的多重比较(Multiple Comparisons)采用LSD法(Least-significant Difference,最小显著差值法)；结肠黏附细菌计数采用独立样本t检验(Independent-Samples T test)；LDH释放率采用独立样本非参数检验。三、结果 1.espF突变株导致细胞凋亡的能力比野生株低 Lovo细胞感染后,EHEC野生株诱导组(WT)可见Caspase-9和Caspase-3清晰蛋白条带,说明Lovo细胞产生了Caspase-9/3凋亡蛋白,而espF基因缺陷突变株诱导组(ΔespF)Caspase-9/3蛋白条带颜色比WT组浅,说明ΔespF感染细胞的凋亡蛋白表达水平低于WT组,但仍高于对照组。其次,各组的Caspase-3蛋白条带颜色深于Caspase-9,说明感染细胞可能进入了凋亡后期。凋亡诱导剂放线菌素D(Act-D)处理组蛋白条带颜色与WT组相仿,空白对照组也可见十分微弱的蛋白条带。 TUNEL法检测Lovo细胞凋亡情况,WT和Act-D感染细胞发现明显绿色荧光,TUNEL阳性细胞数较多,说明细胞发生了较严重的凋亡；ΔespF组细胞绿色荧光较少,TUNEL阳性细胞数也少于WT组,表明其细胞凋亡程度轻于WT组。空白对照组细胞未发现绿色荧光,说明未感染细胞无或极少发生凋亡 2.espF突变株导致小鼠结肠A/E损伤程度比较野生株有所减轻野生株组、突变株组和对照组小鼠经相应细菌感染后,WT组小鼠病死率为30%,较ΔespF组高,小鼠肠道发生水肿,固化粪便较少,是细菌引起的出血性结肠炎的典型表现；ΔespF组小鼠肠道较健康,带有固化粪便,小鼠无死亡WT组感染小鼠结肠重量和黏附细菌数均高于ΔespF组小鼠。用小鼠抗EHEC0157：H7抗体和罗丹明鬼笔环肽,对结肠冰冻切片进行免疫荧光染色观察,WT组结肠肠腔变大,粘膜微绒毛损伤或脱落,部分肠隐窝消失,粘膜上皮细胞表面和隐窝内可见大量绿色荧光；ΔespF组结肠粘膜损伤不明显,肠隐窝结构较完整,细胞表面绿色荧光较少。说明WT组感染小鼠肠道粘膜损伤程度和黏附细菌数均高于ΔespF组感染小鼠。 3. EHEC O157:H7流行菌株的毒力不完全相同 PCR鉴定结果显示,18株细菌中14株含溶血素E-hlyA基因,14株含stx2基因,只有8株含stxl基因。细胞黏附试验和细胞毒性试验发现,所有EHEC菌株黏附能力和细胞毒性均强于对照组,而且stx2基因表达蛋白的毒力强于stxl基因表达蛋白的毒力。其中中国流行菌株882364、01H112和日本流行菌株Cua9的Vero细胞毒性与国际菌株933W/O的细胞毒性接近,明显高于其他菌株。四、结论 1. espF基因N端序列缺失,使细菌的黏附性、细胞毒性和诱导细胞凋亡能力降低,导致肠上皮细胞破坏和A/E损伤程度减轻。表明EspF蛋白是细菌感染引起细胞凋亡的重要毒力因子之一,在肠上皮细胞的细菌定植和启动细胞凋亡程序中至关重要。证实N端为EspF蛋白的功能区。 2. EHEC不同菌株的毒力基因、细菌黏附力和Vero细胞毒性强弱不同,菌株882364、01H112、933W/O、Cua9毒力较强,为进一步的EHEC致病机制研究筛选出较为理想的强毒株。
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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R378

【参考文献】