内皮生长因子和炎症因子环境下单核细胞向淋巴管内皮细胞诱导分化

发布时间：2019-01-30 12:44

【摘要】：淋巴管新生(lymphangiogenesis)与机体组织许多病理生理过程密切相关,例如：恶性肿瘤淋巴转移、免疫排斥反应、创伤组织修复、炎症、继发性淋巴水肿等疾病。近些年来乳腺癌发病率不断升高,乳腺癌手术清扫淋巴结、阻断淋巴管引起的术后上肢淋巴水肿病例也随之增多,对患者的生存质量造成严重影响。因此,研究淋巴管生成机制对于干预淋巴管生成、控制恶性肿瘤淋巴转移、免疫排斥反应或组织淋巴水肿等疾病的发生发展、转归等具有重要意义。单核细胞是外周血单个核细胞中重要的细胞群,在炎症、肿瘤或免疫排斥反应时可以在局部浸润,分化为巨噬细胞以及树突状细胞,在调节淋巴细胞功能和免疫应答等方面发挥重要的作用。近些年来研究发现单核细胞具有多向分化潜能,经特定因子定向诱导可以分化成多种细胞,如上皮细胞、T细胞、肝细胞、成骨细胞以及内皮祖细胞(EPCs)或血管内皮细胞等。其中,体外诱导单核细胞分化为EPCs或血管内皮样细胞并用于血管新生的研究成为近些年来关注的热点。对于EPCs参与血管新生机制方面的研究发现,外周血单核细胞来源的EPCs表现低增殖能力,主要是通过以下方式参与血管新生：直接整合到血管壁；分泌血管内皮生长因子、肝细胞生长因子、趋化因子等促进血管新生。与单核细胞向血管内皮细胞转分化、参与血管新生的研究相比,关于单核细胞向淋巴管内皮细胞转分化的研究尚少。目前的研究发现,单核-巨噬细胞在炎症、肿瘤或免疫排斥反应等病理过程中浸润到局部的数量与淋巴管生成的数量明显相关,甚至发现淋巴管壁有巨噬细胞的掺入,有文献报道单核-巨噬细胞经过活化后可以分泌淋巴管内皮特异性生长因子VEGF-C等,因此认为单核-巨噬细胞与淋巴管新生有密切联系。然而,单核细胞能否转分化为真正的淋巴管内皮细胞?其转分化条件或机制为何?尚缺乏足够的科学证据,有待于通过体外研究来证实。此外,我们前期的研究发现,单核细胞在炎性细胞因子短期刺激下即可表达部分淋巴管内皮标志物。因此,本文假设单核细胞在内皮细胞生长因子和炎症因子环境中可能被诱导分化为淋巴管内皮细胞,或通过分泌VEGF-C等因子来调控淋巴管新生。目的：本研究旨在探讨人外周血单核细胞在内皮细胞生长因子以及炎症因子诱导培养下是否能够分化为淋巴管内皮细胞,及其对VEGF-C等因子的分泌情况,进一步探讨了单核细胞参与调控淋巴管新生的机制。该研究不仅对于揭示淋巴管新生的新的机制,而且对于进一步将单核细胞用于干预淋巴管生成、控制淋巴管相关疾病的发展、转归等具有重要的临床应用意义。方法：用Ficoll密度梯度离心法从健康人外周血分离获取单个核细胞,经FN铺板贴壁法获取单核细胞,用内皮细胞培养基EGM-2培养细胞,实验组加入100ng/ml的LPS刺激细胞,分别用免疫细胞化学,RT-PCR及流式细胞术检测细胞对淋巴管内皮细胞标志物VEGFR-3、Podoplanin、LYVE-1、Prox-1以及内皮细胞共同标志物VEGFR-2、vWF、CD144的蛋白和基因的表达情况。同时还检测了新鲜分离的单核细胞对干细胞标记物CD34、单核细胞标志物CD14的表达情况,研究其向淋巴管内皮细胞分化的可能性。收集细胞培养中的上清,采用ELISA法检测上清中VEGF-C的含量,进一步探讨单核细胞参与调控淋巴管新生的机制。结果：(1)新鲜分离的细胞：①免疫组化染色显示细胞仅对CD14的蛋白表达为阳性。②RT-PCR结果显示细胞仅表达淋巴管内皮细胞标志物VEGFR-3和LYVE-1。③流式检测,结果显示96.6%±0.7%的细胞为CD14阳性细胞；同时表达CD14和CD34的阳性率为0.9%±0.2%；同时表达CD14和VEGFR-3的阳性率为0.1%±0.1%；同时表达CD14和LYVE-1的阳性率为4.08%±0.3%；同时表达CD14和Podoplanin的阳性率为0.2%±0.1%。(2)经EGM-2诱导培养7d的细胞：①荧光免疫细胞化学染色检测显示细胞对淋巴管内皮细胞标志物LYVE-1、Podoplanin、VEGFR-3以及内皮细胞共同标志物VEGFR-2、vWF的蛋白表达结果均呈阳性；②RT-PCR结果显示,EGM-2诱导组细胞对VEGFR-3、Podoplanin、Prox-1、LYVE-1的m RNA的表达呈阳性；对vWF、CD144的表达呈阳性,对于VEGFR-2的mRNA表达则呈弱阳性或者阴性。EGM-2加LPS诱导培养组细胞对上述标记物的表达均为阳性,对于VEGFR-2的mRNA表达则呈弱阳性或阴性,与未加LPS刺激组细胞相比,细胞对淋巴管内皮标志物的表达强度有所升高。③流式结果显示,EGM-2培养组细胞对VEGFR-3的表达率为1.5%±0.2%：LYVE-1的表达率为11.5±0.3%；Podoplanin的阳性率为1.6%±0.2%。加LPS诱导刺激的细胞对上述标志物的表达明显上调：对VEGFR-3的表达率为26.9%±0.7%；LYVE-1的表达率为73.6±0.3%；Podoplanin的阳性率为53.1%±0.5%。④ELISA检测EGM-2诱导组细胞分泌VEGF-C的量为98.2(69.9-153.1)pg/106个细胞；EGM-2加LPS诱导培养组细胞分泌VEGF-C的量为211.4(179.8-437.8)pg/106个细胞。二者相比有统计学意义(P0.001)。结论：①人外周血来源的单核细胞经过FN以及EGM-2等的体外诱导培养,细胞可以同时表达淋巴管内皮特异性标志物VEGFR-3、LYVE-1、Podoplanin、Prox-1以及内皮共同标志物vWF、CD144,而对于VEGFR-2的表达则为弱阳性或者阴性,认为单核细胞可以分化为淋巴管内皮样细胞。②人外周血来源的单核细胞经EGM-2诱导培养后细胞可以分泌VEGF-C,加LPS诱导刺激后分泌量明显增加,认为单核细胞分化成的淋巴管内皮样细胞可以通过旁分泌形式参与调控淋巴管新生。
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【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R363

【参考文献】