冻干重组腺病毒三突变型低氧诱导因子-1α的制备及其生物学效应考察

发布时间：2019-02-11 16:17

【摘要】：研究背景目前我国正逐渐步入老龄化社会,由于高血压、糖尿病、高脂血症等相关疾病发病率的上升,加之现代人们不合理的饮食结构、不良的生活方式以及较大的精神压力,缺血性心血管疾病如冠状动脉粥样硬化性心脏、外周缺血性疾病的发病率逐年上升,病死率、致残率高,不仅严重影响人们的生活质量,而且给社会和家庭带来沉重的经济负担。如今,常规药物治疗、外科和经皮介入血管重建术的快速发展使得大部分患者能够正常的生活工作。然而,仍有一部分患者术后出现再狭窄、微血管功能障碍,或由于弥漫性或严重的病变不适于常规血管成形术,而药物治疗不能有效控制症状。因此,必须再寻求其他新的治疗策略。上世纪90年代以来,人们发现,组织器官缺血时,机体内促血管生成相关因子的表达反应性增加,通过促进缺血组织的血管新生,加速侧枝循环的建立,从而改善血流灌注,但自身代偿往往不充分、不及时,而给予外源性生长因子,即“治疗性血管新生”为缺血性疾病治疗提供了新的思路,是当前国际上最热点研究领域之一。最早用于治疗性血管新生的有血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)和成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor, FGF)。VEGF和FGF通过了Ⅰ期临床试验,但Ⅱ期临床试验的结果却不尽如人意。VEGF不能诱导功能成熟的血管形成,出现血管渗漏、组织水肿等不良反应；FGF治疗可以促进血管新生,但部分患者出现蛋白尿。目前,有关VEGF和FGF的临床研究已经停止。人们逐渐意识到血管新生是一个复杂的生物学过程,单纯针对某阶段或应用单一因子干预治疗难以形成趋近生理状态的成熟的新生血管。如何实现理想血管重建是血管新生领域的重大挑战,近年来研究显示：低氧诱导因子-1(Hypoxia-inducible factor-1, HIF-1)是一个非常重要的核转录因子,由α和β两个亚基组成,α为其功能活性亚基。HIF-1α与β结合后,从胞浆转位到核内,直接或间接调控多种下游靶基因,涉及到血管生长、血管张力、糖代谢、红细胞生成等多种病理生理改变。到目前为止,已发现参与血管新生的30多种基因受HIF-1α的调控,因此,HIF-1α是血管新生的上游核心调控因子。临床前期研究表明,HIF-1α治疗诱导的新生血管具有无明显炎症反应、不渗漏、不引起组织水肿的特点从而形成生理功能完整的新生血管。因此,HIF-1α是一个十分具有应用前景的血管新生治疗因子。然而,HIF-1α在常氧下的半衰期很短,5min即可全部降解。这是由于HIF-1α含有氧依赖降解区(Oxygen Dependent Degradation Domain, ODDD), ODDD区Pro402以及Pro564两个脯氨酸残基是否羟基化决定其蛋白稳定性。常氧情况下,Pro402和/或Pro564被脯氨酸羟化酶(prolyl hydroxylase domain, PHD)羟化后,经泛素途径降解。低氧时,该过程受到抑制,HIF-1α不被降解因而变得稳定。氧浓度除了对HIF-1α蛋白稳定性调节以外,更为重要的是对HIF-1α转录活性调节。HIF-1α的C末端含有转录激活区(C-Transactivation Domains,C-TAD),常氧情况下,C-TAD803位点的天门冬酰胺(Asn803)被羟化,可阻止HIF-1α与部分辅助激活因子(如CBP/p300)的结合,降低其转录活性。故即使蛋白稳定的HIF转位到核内后,因HIF-1α的C-TAD Asn803羟化,降低了激活下游靶基因的能力。低氧时,该过程受到抑制,不能有效的催化结构域内Asn803羟基反应,从而导致HIF-1α的高转录活性。在此基础上,本课题组将HIF-1α的ODDD区Pro402和Pro564以及C-TAD区Asn803进行了点突变,并选择具有可转染非增殖细胞并且转染效率高、无致瘤性、容易获得高滴度等优点的腺病毒作为基因载体,成功构建腺病毒介导的三突变型HIF-1α(Ad-HIF-1α-Trip),使其在常氧不仅能稳定表达,而且具有高转录活性,可以促进下游血管生成因子的表达,有利于诱导成熟的血管新生。尽管我们已验证了Ad-HIF-1α-Trip高生物学活性并在动物实验中取得了成功,可望应用于临床,但是腺病毒在溶液中理化性质不稳定、不耐热,通常需保存在含有冷冻保护剂的缓冲液中,并于-80℃储存。由于运输必须在干冰上进行、储存冷链限制、使用前需要冻融等因素,限制了其未来的临床应用。冷冻干燥是将含水物料低温冷冻使之冻结,然后在低温、高真空条件下使冰转变为水蒸气,除去自由水,再进行第二次干燥,除去部分吸附于固体间隙中的结合水的干燥方法。其优点和意义在于：冰的升华带走热量使冻干整个过程保持低温冻结状态,因此非常适用于热敏具有生物活性药品的干燥；真空状态可以对药品起到抗氧化的作用；而干燥后的物质含水量非常少、重量轻,有利于在0-4℃甚至室温条件下保存和运输；使用方便,加蒸馏水或生理盐水制成溶液,即可恢复到冻干前的状态。在冻干过程以及储存过程均存在影响药品稳定性的因素,需要添加冻干保护剂,而不同的物料由于其结构和组分的差异,冻干保护剂也不尽相同,选择合适的冻干保护剂是制备出高质量冻干产品的关键。此外,Ad-HIF-1α-Trip用于基因治疗,需要通过实验考察冻干后Ad-HIF-1α-Trip的生物学活性。目的筛选合适的冻干保护剂制备冻干Ad-HIF-1α-Trip,观察其在0-4℃条件下保存长期稳定性并且考察冻干后Ad-HIF-1α-Trip的生物学活性,为Ad-HIF-1α-Trip将来临床应用提供剂型方面的实验依据。。方法 1.将重组腺病毒载体Ad-HIF-1α-Trip、Ad-Null以及Ad-LacZ在低代HEK293A细胞中进行病毒扩增；氯化铯浓度梯度离心透析纯化；纯化后提取病毒DNA进行PCR检测,同时行基因测序进行鉴定；终点稀释法测定病毒滴度。 2.初选3组处方,其组成(w/v)：A.10%海藻糖、0.5%明胶、3%山梨醇；B.10%蔗糖、0.5%明胶、3%山梨醇；C.5%海藻糖、5%蔗糖、0.5%明胶、3%山梨醇；按照上述保护剂分组的百分比要求,加入到磷酸盐缓冲液中,分别与稀释的Ad-HIF-1α-Trip原液按1：1比例混合,0.5ml/西林瓶分装,以适当冻干曲线进行冻干。根据冻干后物理性状、病毒滴度测定筛选冻干保护剂。进行加速热稳定性试验,并在冻干后1天以及第3、6、12个月测定病毒滴度观察冻干Ad-HIF-1α-Trip热稳定性和长期稳定性。 3. Ad-LacZ以不同转染复数(MOI)转染微血管内皮细胞(hMVECs),经X-Gal染色法测定重组腺病毒转染效率。96孔板培养hMVECs,冻干前Ad-HIF-1α-Trip、冻干后Ad-HIF-1α-Trip分别以最佳MOI转染细胞,在转染后第24,48,72,96,120小时用MTS方法检测测细胞增殖的情况。 4.分别在Ad-HIF-1α-Trip冻干后1天、冻干后6月、冻干后12月时间点提取病毒DNA,进行PCR及PCR产物测序鉴定三突变型HIF-1α基因；并在上述3个时间点以Ad-HIF-1α-Trip转染hMVECs,提取72小时蛋白进行western blot检测HIF-1α蛋白的表达及下游VEGF蛋白的表达,与液体Ad-HIF-1α-Trip加以比较。 5.应用SPSS13.0统计软件进行数据分析,计量数据以x±s表示。冻干后不同保护剂组间Ad-HIF-1α-Trip滴度比较采用单向方差分析,方差齐时组间多重比较采用LSD法,方差不齐时采用Games-Howell检验；各组冻干前后滴度比较采用单样本t检验。冻干后腺病毒加速热稳定性试验、长期稳定性试验所测得滴度、MTS测得吸光度值组间比较及组内不同时间比较采用重复测量的方差分析,多重比较采用LSD法；加速热稳定性试验同一时间点组间比较采用两独立样本t检验,长期稳定性试验、MTS测得吸光度值组问比较采用单向方差分析。P0.05差异有统计学意义。结果 1.在HEK293A细胞内反复扩增后获得重组腺病毒Ad-HIF-la-Trip、Ad-Null和Ad-LacZ经氯化铯纯化后,终点稀释法测得的滴度分别为12.6LgPFU/ml、11.2LgPFU/ml、10.3LgPFU/ml。提取Ad-HIF-1α-Trip病毒DNA,PCR检测HIF-1α基因得到预期的380bp、460bp、214bp的目的片段,且DNA测序结果符合实验要求。 2.以10%海藻糖、0.5%明胶、3%山梨醇保护剂制备的冻干腺病毒外观呈白色饼块状,残余水分含量3%,冻干后Ad-HIF-1α-Trip感染性滴度下降0.33LgPFU/ml,相比其他保护剂组具有较好的保护效果(P0.01)；冻干Ad-HIF-1α-Trip与液体Ad-HIF-1α-Trip在37℃条件下放置滴度均呈下降趋势,但冻干Ad-HIF-1α-Trip下降幅度小,放置3周后,滴度仅下降0.8LgPFU/ml,热稳定性好于液体腺病毒组(P0.01)；冻干Ad-HIF-1α-Trip在0-4℃保存12月,滴度仅下降0.67LgPFU/ml。其稳定性好于0-4℃保存液体Ad-HIF-1α-Trip组和添加甘油保护剂-20℃保存的Ad-HIF-1α-Trip组(P0.01), 3.Ad-LacZ以不同MOI转染hMVECs, X-gal染色结果显示当MOI为100pfu/cell时,重组腺病毒的感染效率趋于稳定,均在75%以上。MTS检测显示,液体Ad-HIF-1α-Trip和冻干Ad-HIF-1α-Trip对hMVECs增殖无显著差异(P0.05),但均与空白对照组之间有显著差异(P0.01)。 4.经PCR及基因测序鉴定,冻干后1天、6月、12月的腺病毒所携带的目的基因信息无丢失或变异；western blot结果显示：冻干后1天、6月、12月的Ad-HIF-1α-Trip与液体Ad-HIF-1α-Trip转染hMVECs后HIF-1α蛋白以及VEGF蛋白表达量与相当,且均高于Ad-Null组表达水平。结论 1.本课题组构建的重组腺病毒载体Ad-HIF-1α-Trip、Ad-Null和Ad-LacZ扩增后能获得较高的滴度,且转染效率高,为下一步实验提供了保证。 2.以合适的保护剂制备冻干Ad-HIF-1α-Trip(?)能达到较满意的冻干效果。冻干后Ad-HIF-1α-Trip在0-4℃条件下能够长期稳定保存。 3.冻干后Ad-HIF-1α-Trip仍具有良好的促进hMVECs增殖。 4.冻干能够长期保持Ad-HIF-1α-Trip的高生物活性。
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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R363

【参考文献】