T病毒RNA在Hela细胞内发生复制并诱导细胞凋亡的相关途径研究

发布时间：2019-02-12 13:53

【摘要】：研究背景及目的：自然选择法则决定了病毒进化需要不断扩展其入侵的宿主范围。病毒基因组的高变性使得越来越多的远缘病毒进化到感染人体并引发很多致死性传染病的暴发流行。源于野生动物的的HIV、SARS病毒、禽流感病毒在人类的暴发与流行,从侧面反应了这一现状。T病毒,这种更远缘的病毒会不会进化到不识别特异性受体而直接入侵人类细胞?为了提前预知这种病毒的核酸是否可以在人体内会产生生物学效应,本研究旨在观查并分析T病毒RNA进入Hela细胞后的复制情况,以及其是否能够诱导Hela细胞发生凋亡,并进一步推断细胞发生凋亡的作用途径是否与细胞内天然免疫反应密切相关。研究内容及方法：第一部分,将T病毒RNA借助脂质体转染入人类Hela细胞后,主要从蛋白、mRNA表达、形态学三方面验证T病毒RNA在Hela细胞内的复制情况,包括：1) Western blotting检测T病毒蛋白的表达；2)RT-RCR及实时定量PCR检测T病毒基因组正负链的合成；3)Northern blotting检测T病毒基因组和亚基因组的存在；4)通过电镜(细胞切片、负染色及免疫胶体金染色)证明T病毒子代病毒颗粒在Hela细胞内的存在；5) RT-RCR、Western blotting、电镜(细胞切片、免疫胶体金染色)检测病毒在细胞间及病毒从细胞到植物或裸鼠体内的传代表达情况。第二部分,采用IF-RNA-FISH技术对T病毒基因组和蛋白进行细胞内定位；同时采用活细胞动态成像技术示踪T病毒RNA在Hela细胞内的运动轨迹。第三部分,本小组前期研究推断T病毒RNA导入后可能通过内质网应激反应(Endoplasmic reticulum stress, ERS)诱导Hela细胞发生自噬(Autophagy)。自噬作为天然免疫防御机制之一,在抗感染晚期促进细胞凋亡。因此,本部分通过Anecin V-PI染色流式对Hela细胞的凋亡情况进行检测。为了分析凋亡的相关作用途径,首先采用Western blotting及流式细胞术检测自噬基因LC3的表达,确认自噬的发生；然后采用RT-RCR及Western blotting检测GRP78在内质网上的表达,确认内质网应激的发生；最后借助电镜及活细胞动态成像技术观察并分析T病毒核酸、蛋白与内质网应激(ERS)及自噬(Autophagy)间的相互作用关系。研究结果： 1.T病毒RNA导入Hela细胞后不仅合成了自身核酸、蛋白,组装出了T病毒子代病毒颗粒,而且还可以在Hela细胞间以及从Hela细胞到T病毒宿主或裸鼠体内传代表达,说明其在Hela细胞内发生了复制,且具有很高的生物学活性。 2.IF-RNA-FISH结果显示：随转染时间的延长,T病毒部分核酸逐渐从细胞质聚集于细胞核核仁；T病毒蛋白(CP)始终定位于细胞质中。活细胞动态成像也显示了T病毒RNA从内质网(ER)到细胞核的运动轨迹。 3.流式检测结果显示：T病毒RNA导入后Hela细胞发生了凋亡。除确认自噬发生(自噬基因LC3蛋白的转化、高表达；电镜下出现典型的自噬体及自噬溶酶体、自噬空泡数量显著增多)及内质网应激发生(GRP78在内质网上的高表达)外,免疫电镜结果显示：部分T病毒蛋白出现在内质网、自噬体膜及核膜附近,且随时间延长聚集于自噬体膜表面,同时电镜结果提示自噬体膜可能来源于内质网膜,推测内质网应激后,内质网膜扩张导致自噬前体形成,T病毒蛋白随内质网扩张部分进入自噬体,或被自噬机制降解或利用自噬存活；双光子共聚焦显微镜结果显示T病毒RNA与一些GFP-LC3标记的自噬小体共定位于内质网,且活细胞动态成像结果呈现了T病毒RNA从进入细胞到与自噬体融合的运动轨迹,这一过程发生在内质网上,推断T病毒RNA的复制行为导致内质网应激,进而引发细胞自噬,自噬后期诱导细胞发生凋亡。研究意义：病毒的进化和人类的探索活动拉近了人与不同物种间的距离,跨生物界生命物质比以往任何时候都更容易发生交叉与融和。病毒本身的高度变异,使得病毒能否入侵人体细胞,已经不完全决定于特异性受体的有无。该课题瞄准跨生物界远缘病毒入侵这一空白研究领域,以对人类无特异性受体、无主动侵袭性的T病毒和人类宫颈癌Hela细胞系为模型,首次对T病毒对非宿主细胞的作用机制进行了较为系统和深入的研究,突破原有的病毒相关细胞膜受体研究思路,从一个全新的角度探索病毒预防的策略。
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【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R392

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