不同毒力株弓形虫排泄—分泌抗原（ESA）对小鼠免疫细胞亚群的影响

发布时间：2019-02-15 14:27

【摘要】：刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）是人畜共患细胞内寄生原虫。免疫功能正常的机体感染弓形虫，绝大多数表现为隐性感染，但孕妇、婴幼儿和免疫抑制者感染后，则分别可能导致流产、畸胎或急性获得性弓形虫病，死亡率甚高，危害严重。弓形虫虫体侵入宿主细胞后，在细胞内大量繁殖，排泄分泌大量抗原性物质，即弓形虫ESA（excreted-secreted antigens），参与引起宿主损伤和免疫反应。作为一种重要的机会性致病原虫，弓形虫的致病作用与虫株毒力、宿主免疫状态密切相关。据侵袭力、繁殖速度、致死率、包囊形成与否等的不同，刚地弓形虫可分为强毒株系和弱毒株系。强毒株以RH株为代表，对常用的实验动物小鼠都极为敏感，感染后速殖子在体内可迅速增殖，引起急性的致死性感染，3-5天即死亡。弱毒株PRU株则为成囊株，感染包囊后的小鼠平均在一周后发病，数周后才出现死亡或形成长期慢性感染。弓形虫感染宿主后的结果取决于宿主与虫体间的相互作用。宿主方面，，细胞免疫一直被认为是机体抵抗弓形虫感染保护性免疫的基础，在抑制虫体繁殖、清除虫体、控制虫血症方面起重要作用。近年来，随着一群具有抑制功能的CD4~+CD25~+调节性T细胞的发现与深入研究，越来越多的证据表明此群细胞在调节病原体感染免疫中起重要作用，研究发现它们可以在一定程度上通过影响感染部位免疫应答的敏感性来抑制过度的免疫应答，从而导致病原体的长期存在。本实验室前期研究发现，弓形虫RH株ESA腹腔接种孕鼠，同样可以导致孕鼠流产，引起体内NK细胞数量上升及CD4~+CD25~+调节性T细胞数量下降。研究表明，ESA对机体所产生的影响与弓形虫感染所致的影响相似。然而目前为止有关这些虫源性物质对机体免疫细胞的影响，研究还不深入。那么不同毒力株弓形虫ESA对正常机体的免疫细胞影响是否会有不同？这些免疫细胞的状态是否与不同毒力株感染后的结局有关联？结合上述资料和问题，本研究旨在探讨不同毒力株弓形虫ESA对小鼠免疫细胞亚群的影响，观察不同毒力株ESA对正常小鼠体内NK细胞、CD4~+CD25~+T细胞的影响，并初步探讨其变化机制，为今后弓形虫病的免疫预防和干预提供理论基础。我们建立弓形虫不同毒力株ESA处理小鼠模型，流式细胞术检测各组小鼠脾脏中NK细胞、CD4~+CD25~+T细胞数量比例变化。磁珠分选NK细胞，采用LDH法检测NK细胞对YAC-1细胞的杀伤功能；采用RT-PCR方法检测NK细胞中颗粒酶B表达水平。同时磁珠分选CD4~+CD25~+调节性T细胞，3H-TdR掺入细胞增殖实验检测不同处理组脾脏CD4~+CD25~+调节性T细胞抑制功能。采用ELISA检测不同处理组小鼠血清IFN-γ的分泌水平等。本研究获得如下主要结果： 1.采用无血清体外培养的方法，成功制备RH株、PRU株ESA，经BCA蛋白定量法测定，RH株ESA蛋白浓度为0.48mg/mL，PRU株ESA蛋白浓度为1.9mg/mL。为确定处理浓度，采用不同剂量RH株ESA注射小鼠，流式细胞仪检测结果显示，不同剂量RH株ESA处理小鼠，小鼠脾脏NK细胞占脾细胞的比例与PBS对照组相比均有上升，在0.002mg的剂量下已出现较为明显的上升，因此，我们采用0.002mg作为处理剂量建立小鼠模型，观察各细胞亚群变化。 2.不同毒力株ESA接种小鼠，小鼠脾脏NK细胞数量比例增加。流式细胞仪检测结果显示，不同毒力株ESA处理小鼠，脾脏NK细胞占脾细胞的比例较PBS对照组均上升，其中注射RH株ESA上升最明显，与PRU株差异存在统计学意义。 3.不同毒力株ESA接种小鼠，小鼠血清IFN-γ分泌水平升高。ELISA结果显示，不同毒力株ESA处理，小鼠血清IFN-γ分泌显著高于对照组水平，其中RH株处理组高于PRU株处理组。 4.不同毒力株ESA接种小鼠，小鼠脾脏CD4~+CD25~+调节性T细胞数量比例降低。流式细胞仪检测结果显示，不同毒力株ESA处理小鼠，脾脏CD4~+CD25~+调节性T占脾细胞的比例较PBS对照组均下降，其中注射RH株ESA下降最明显，与PRU株差异存在统计学意义。 5.不同毒力株ESA接种小鼠，小鼠NK细胞杀伤功能增强。磁珠分选各处理组小鼠NK细胞，LDH法检测结果显示， ESA处理组小鼠脾脏的NK细胞较未处理NK细胞杀伤靶细胞YAC-1细胞的功能增强，其中RH株ESA处理组杀伤能力强于PRU组。 6.不同毒力株ESA接种小鼠，小鼠CD4~+CD25~+调节性T细胞抑制功能增强。磁珠分选各处理组小鼠CD4~+CD25~+T细胞，3H-TdR掺入法细胞增殖实验结果发现，在抗CD3的刺激下，ESA处理组小鼠脾脏的CD4~+CD25~+T细胞抑制CD4+CD25-T细胞增殖的能力较正常对照组明显下降，其中RH株处理组抑制功能下降较PRU株处理组明显。 7.磁珠分选正常小鼠NK细胞、CD4~+CD25~+调节性T细胞，体外与不同毒力株ESA共培养，LDH法检测NK细胞对CD4~+CD25~+调节T细胞的特异性杀伤。结果显示，不同毒力株ESA处理的小鼠NK细胞杀伤能力较对照组有明显的升高，三组间差异有统计学意义。RH株ESA处理组杀伤率强于PRU株处理组。以上研究结果提示，NK细胞的数量与活性增加，CD4~+CD25~+调节性T细胞数量减少、抑制功能的增强在不同毒力株ESA致小鼠不同免疫应答状况中可能起到重要作用；不同毒力株ESA处理小鼠后，刺激NK细胞数量上升与功能增强的程度不同，引起CD4~+CD25~+调节性T细胞数量减少及抑制功能增强程度也不同。该结果可能部分解释弓形虫不同毒力株致病性的差别。
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【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R392

【参考文献】