荚膜透明质酸在新生隐球菌跨肺泡—毛细血管屏障过程中的作用研究

发布时间：2019-03-20 18:33

【摘要】：背景新生隐球菌是一种具有荚膜的重要条件致病真菌,广泛存在于自然界,对于一般健康人不致病,免疫力低下和免疫缺陷患者足此菌的易感人群。隐球菌病(Cryptococcosis)是由隐球菌属中某些种或变种引起的脑膜、脑、肺、骨骼、皮肤或是全身慢性或亚急性甚至急性感染。近年来由于免疫抑制剂的使用和AIDS病的增多,新生隐球菌感染发病率呈明显上升趋势,已经成为一种严重危害人类健康的疾病。因此,新生隐球菌的研究已受到全球真菌研究学者的高度重视。新生隐球菌(Cryptococcus neoformans)主要致病途径是以孢子的形式经由呼吸道吸入,通过无症状的肺部感染,然后新生隐球菌穿越肺泡-毛细血管屏障入血引起其他深部组织感染(主要是中枢神经系统)。其发生的关键步骤为肺泡中的新生隐球菌穿越肺泡-毛细血管屏障,又称血气屏障(blood air barrier,BAB),位于肺泡与肺泡毛细血管之间,由六层组成：肺表面活性物质的液体层；肺泡上皮细胞层；上皮基膜；肺泡与毛细血管之间的间隙；毛细血管的基膜；肺微血管内皮细胞(human pulmonary microvascular endothelial cell,HPMEC)。其功能是使肺泡中O2与毛细血管血液内的CO2顺利完成交换,并有防御病菌入侵和防止毛细血管内其他物质流失的作用。其中胚泡-毛细血管屏障主要的组成部分是肺微血管内皮细胞。新生隐球菌成功穿越肺泡-毛细血管屏障需要经过黏附及侵袭进入肺微血管内皮细胞,目前人们对新生隐球菌侵入肺泡-毛细血管屏障的分子机制所知甚少,是新生隐球菌疾病防治需解决的重要问题。多糖荚膜是新生隐球菌经典的毒性因子,是新生隐球菌逃避宿主免疫的主要毒性因子。Ambrose Jong等研究表明：新生隐球菌荚膜成分-透明质酸(hyaluronic acid,HA)是由新生隐球菌的CPS1基因编码合成,目前已经利用染色体同源重组技术,构建了新生隐球菌B4500F02株的CPS1基因缺失株TYCC645#32, CPS1敲除菌株检测不到HA,且对脑微血管内皮细胞的粘附率明显降低,证明HA作为一种粘附分子,在与脑微血管内皮细胞相互作用过程中具有重要意义,是粘附脑微血管内皮细胞的重要毒力因子。脑微血管内皮细胞上CD44是新生隐球菌HA的受体,新生隐球菌感染脑微血管内皮细胞后,经过一系列信号转导使细胞骨架重排,使新生隐球菌进入宿主细胞；CD44是属于黏附因子家族的跨膜糖蛋白,它广泛表达于多种内皮细胞、间充质细胞、造血干细胞及中胚层来源的细胞和组织,分子量约80-95KD,可以与HA、GAG、胶原、层黏连蛋白、纤黏连蛋白、选择蛋白等结合,由于在很多细胞研究发现CD44是HA的受体,我们推断在HPMEC也存在CD44,新生隐球菌荚膜HA与HPMEC上的CD44结合是其入侵机制的一部分。动物实验对于系统性研究新生隐球菌感染机理是至关重要的,常用的动物模型主要有四种,分别为小鼠、豚鼠、大鼠和兔,其中小鼠是对新生隐球菌最为敏感的动物,因此,小鼠是新生隐球菌研究最常用的动物模型。根据实验需要、感染部位的不同,新生隐球菌目前常用的感染造模方法主要有腹腔、静脉、鼻腔、气管内和颅内注射接种等。由于新生隐球菌通常是由呼吸道吸入而引起感染,为明确荚膜HA是否参与新生隐球菌黏附和侵袭肺泡-毛细血管屏障的致病过程,需要通过动物实验观察新生隐球菌穿越肺泡-毛细血管屏障的能力,要模拟其正常感染,可通过雾化吸入装置的感染方式让小鼠自然感染新生隐球菌,目前超声雾化吸入已经成功地应用于多种动物吸入性细菌感染,由于新生隐球菌感染主要发生于免疫力低下的人群中,因此研究新生隐球菌的致病机理包括应用免疫抑制的动物模型与新生隐球菌致病的关系。目的本研究将利用肺微血管内皮细胞HPMEC(human pulmonary microvascular endothelial cell)单层细胞,通过体外实验比较野生株及突变株对HPMEC的黏附和侵袭水平；利用细胞免疫荧光技术,比较两者诱导HPMEC上CD44表达差异和肌动蛋白重排的能力；利用免疫印迹技术,比较两者诱导HPMEC上CD44蛋白表达的差异；利用免疫抑制小鼠超声雾化吸入新生隐球菌模型,明确HA是否影响致病菌穿越肺泡-毛细血管屏障的能力。研究方法 1、真菌计数法检测新生隐球菌对HPMEC细胞的粘附和侵袭率：实验前48小时,将24孔板用胶原蛋白collagen包被半小时,然后每孔接种105HPMEC,48小时后长成单层备用。待测新生隐球菌于酵母YPD完全培养液中30℃250rpm振荡培养12小时,收集对数生长期细胞,PBS洗涤后并重悬于PBS稀释备用,按感染倍数100,即新生隐球菌数：细胞数约100：1加入待测菌,每组三个复孔,同时留样涂平板培养计数获得准确新生隐球菌浓度。37℃孵育1、3和5小时后,PBS清洗3次后裂解细胞并涂布YPD平板计菌落数,此为黏附与侵袭的新生隐球菌总数,并计算黏附与侵袭率。 2、免疫荧光方法检测新生隐球菌感染后HPMEC的CD44表达：细胞培养玻片用胶原蛋白collagen包被半小时,每孔接种104HPMEC细胞,48小时后长成单层,然后将106新生隐球菌B4500F02和TYCC645#32加到细胞单层上,并设置空白对照,37。C共同孵育3小时,预冷的PBS洗3次,4%多聚甲醛固定,5%BSA封闭,加入1：100CD44一抗4℃孵育过夜,回收一抗后用预冷的PBS洗3次,然后加1：100绿色荧光标记的羊抗兔二抗孵育1小时,预冷的PBS洗涤后,最后用抗荧光淬灭剂封片,24小时后荧光显微镜观察。 3、免疫荧光方法检测新生隐球菌感染后HPMEC的actin的表达：细胞培养玻片用胶原蛋白collagen包被半小时,每孔接种104HPMEC细胞,48小时后长成单层,然后将106新生隐球菌B4500F02和TYCC645#32加到细胞单层上,并设置空白对照,37。C共同孵育3小时,预冷的PBS洗3次,4%多聚甲醛固定,5%BSA封闭,然后在相应孔中加入Rhodamine标记的phalloidin (Sigma,1:300)室温作用1h, PBS洗涤后,最后用抗荧光淬灭剂封片,24h后荧光显微镜观察。 4、免疫印迹方法检测新生隐球菌感染后HPMEC的CD44蛋白表达：直径100mm细胞培养皿用胶原蛋白collagen包被半小时,每个培养皿接种约106HPMEC细胞,3天后长成单层,然后将108新生隐球菌B4500F02和TYCC645#32加到细胞单层上,37℃共同孵育3小时,预冷的PBS洗3次,再用RIPA裂解细胞,提取细胞蛋白,然后进行免疫印迹实验,CD44抗体检测细胞CD44表达情况。 5、动物模型的建立：采用6周龄的Balb/c小鼠,用环磷酰胺(CTX)建立免疫抑制小鼠模型,然后采用超声雾化器将新生隐球菌悬液雾化成汽雾颗粒,使小鼠在自主呼吸过程中吸入该菌,模拟新生隐球菌的正常侵入方式。感染后6h、3d和7d分别检测血、肺和脑的菌落数,并取肺组织,用2.5%福尔马林固定,行HE染色和PAS染色病理检查。实验结果 1、新生隐球菌荚膜HA与其黏附与侵袭HPMEC细胞相关野生株B4500FO21、3和5小时的黏附与侵袭率分别为0.0123±0.0025%、0.055±0.0041%和0.012±0.0041%,而TYCC645#32各时间点黏附与侵袭率分别为0.005±0.0017%、0.025±0.0044%和0.0004±0.0007%, TYCC645#32各时间点黏附与侵袭率均低于B4500FO2相对应时间的粘附与侵袭率,差异有统计学意义(p0.05)。 2新生隐球菌荚膜HA促进HPMEC细胞上CD44的表达应用免疫荧光方法,我们发现CD44表达于HPMEC,经新生隐球菌野生株感染的HPMEC的细胞膜上强的绿色荧光条带,而在突变株孵育组荧光强度明显弱于野生株组,未孵育新生隐球菌的正常HPMEC细胞绿色荧光很弱。并且通过免疫印迹方法,我们发现HPMEC表达CD44,特异性条带出现在分子量约为95KD处,而且在内参蛋白actin(分子量45KD)条带基本一致,与新生隐球菌野生株共培养3小时后HPMEC的CD44蛋白表达增强,而突变株孵育组CD44条带明显较弱。 3、新生隐球菌荚膜HA导致HPMEC细胞骨架肌动蛋白actin的改变应用免疫荧光方法,我们发现被新生隐球菌野生株感染的HPMEC细胞胞质肌动蛋白减少,纹理不清,出现边缘聚集以及毛刺样改变,而突变株孵育组也出现类似情况,但改变程度明显弱于野生株组,未孵育新生隐球菌的正常HPMEC组肌动蛋白分布均匀。 4、新生隐球菌荚膜HA与其侵入免疫抑制小鼠肺组织相关6周龄的Balb/c小鼠被免疫抑制后,超声雾化吸入新生隐球菌野生株B4500F02及突变株TYCC645#32,感染后6h、3d及7d后,血样、肺及脑组织匀浆样本涂布YPD平板计菌落数。感染后6h CPS1基因缺失株TYCC645#32组与野生株B4500FO2组肺部定植菌量相似(Z=-0.641,p0.05),然而在雾化吸入感染后3d和7d CPS1基因缺失株TYCC645#32组在外周血、肺和脑组织中的菌量均低于野生株B4500F02组。病理检查发现B4500FO2组在感染后6h和3d肺泡炎症弥漫,有充血渗出,7d基本正常；而TYCC645#32组只有在感染后6h肺泡及间质有明显炎症,其他两个时间点肺泡结构正常。统计学分析：数据均表示为均数±标准差。野生株和突变株两组间粘附与侵袭率的比较采用Mann-Whitney Test检验。动物实验外周血白细胞数的比较采用配对t检验。动物实验野生株和突变株两组小鼠外周血CFU比较采用两样本t检验。肺和脑组织CFU总体的比较采用kruskal-wallis检验,进一步两两比较采用Bonferroni法。P0.05认为差异有统计学意义,检验水准为α=0.05。数据分析采用SPSS17.0软件。结论：为了明确荚膜HA在新生隐球菌致病的相关作用,我们利用CPS1野生株和敲除株进行体外、体内肺泡-毛细血管屏障模型实验对相关机制进行了研究。结果显示,在体外实验中,CPS1的基因敲除株TYCC645#32对HPMEC的黏附和侵袭水平明显低于野生株B4500F02；与之一致的是,体内实验中TYCC645#32穿越肺泡-毛细血管屏障的能力也低于B4500F02。为了检测CPS1基因敲除是否会对新生隐球菌诱导的细胞CD44产生影响,我们将野生株及突变株与HPMEC孵育后,利用细胞免疫荧光技术和免疫印迹技术检测B4500F02及突变株TYCC645#32感染后HPMEC的CD44表达情况,野生菌孵育组CD44蛋白表达更强,在细胞免疫荧光实验中表现出强的绿色荧光；而在免疫印迹实验中表现为CD44蛋白条带明显增粗,当敲除CPS1后,突变株诱导HPMEC的CD44表达能力明显弱于野生株组。在许多致病菌入侵宿主细胞时,都会造成宿主细胞骨架如肌动蛋白的重排及下游信号通路的激活。这种情况同样存在于新生隐球菌。为了检测CPS1基因敲除是否会对新生隐球菌诱导的细胞骨架重排产生影响,我们将野生株及突变株与HPMEC呼育后,用罗丹明-鬼笔环肽对肌动蛋白进行染色,发现在正常的HPMEC内,肌动蛋白排列非常均匀。而野生株感染的HPMEC,肌动蛋白在胞质内分布减少,而出现边缘聚集现象,且可以观察到突触的形成。突变株处理过的HPMEC虽然也存在肌动蛋白重排现象,但明显弱于野生株。综合以上结果我们可以得出如下结论：荚膜HA与新生隐球菌通过肺泡-毛细血管屏障致病有着重要的关系,但荚膜HA与HPMEC的CD44结合后,又是通过怎样具体的下游信号通路及机制来影响着新生隐球菌的侵入,将是我们后续研究中需要探索的问题。
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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R379

【参考文献】