负载NY-ESO-1多肽的人树突状细胞特异性抗肿瘤的体外研究

发布时间：2019-03-25 07:19

【摘要】：目的检测负载肿瘤/睾丸抗原NY-ESO-1多肽的人树突状细胞(dendritic cell, DC)诱导的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)体外特异性抗肿瘤的免疫效应,获得能够诱导CTL对多种肿瘤均产生较强杀伤作用的NY-ESO-1多肽,为肿瘤的免疫治疗提供重要的理论依据。方法 1.通过网站SYFPEITHI (http://www.syfpeithi.de)的超基序法、结合多项式方案及量化基序法预测NY-ESO-1抗原表位,获得三条HLA-A2限制性多肽并人工合成。 2.分别选择HLA-A2表型阳性的人肝癌细胞株MHCC97-H、结肠癌细胞株SW480、脑胶质细胞瘤U251和HLA-A2表型阴性的人胃癌细胞株SGC-7901,常规培养肿瘤细胞。 3.通过逆转录聚合酶链反应(reverse transcription PCR, RT-PCR)法和免疫细胞化学技术检测肿瘤细胞株NY-ESO-1的表达情况,对于NY-ESO-1阴性的肿瘤细胞,利用5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-Aza-2’-deoxycytidine, 5-Aza-CdR)诱导其重新表达NY-ESO-1。 4.联合应用重组人粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(recombination human granulocyte/macrophage colony-stimulating factor, rhGM-CSF)和白细胞介素4(recombination human interleukin-4, rhIL-4)诱导培养人脐带血DC,肿瘤坏死因子(recombination human Tumor necrosis factor-α, rhTNF-α)诱导其成熟,通过倒置显微镜、普通光学显微镜及透射电镜观察细胞形态,应用流式细胞术检测细胞表面分子HLA-DR、CD83、CD86的表达情况,进行同种混合淋巴细胞反应鉴定DC功能。 5.联合应用重组人白细胞介素2(recombination human interleukin-2, rhIL-2)和植物血凝素(phytohaemagglutinin, PHA)培养人脐带血T淋巴细胞,通过NY-ESO-1多肽致敏DC,后者诱导CTL活化、扩增。乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)释放法检测CTL对NY-ESO-1阳性肿瘤细胞的杀伤率,从而筛选出能够诱导CTL对多种肿瘤细胞均产生较强杀伤作用的NY-ESO-1多肽。结果 1.获得超基序法分值在20分以上的五条NY-ESO-1九肽,并结合多项式方案和量化基序法,选择多项式系数和结合系数最高的三条NY-ESO-1九肽:p86-94(RLLEFYLAM)、p108-116(SLAQDAPPL)、p159-167(LMWITQCFL),通过化学合成法人工合成多肽。 2.成功筛选出NY-ESO-1阳性的人胃癌细胞株SGC-7901,而人肝癌细胞株MHCC97-H、结肠癌细胞株SW480及脑胶质瘤细胞株U251均不表达NY-ESO-1。 3.通过5-Aza-CdR成功诱导NY-ESO-1阴性的人肝癌细胞MHCC97-H、结肠癌细胞SW480及脑胶质瘤细胞U251重新表达NY-ESO-1。 4.联合应用细胞因子rhGM-CSF、rhIL-4及rhTNF-α从人脐带血中成功培养获得较多量DC,培养8天后细胞体积增大,半贴壁,形态不规则,有典型的树枝状突起,流式细胞术检测不成熟DC(immature DC, imDC)和成熟DC(mature DC, mDC)表面分子HLA-DR、CD83、CD86的表达率分别为37.12%、3.77%、21.58%和93.53%、55.21%、69.12%,mDC能显著刺激淋巴细胞的扩增。 5.通过LDH释放法检测,负载NY-ESO-1p86-94多肽DC诱导的CTL对人肝癌细胞株MHCC97-H、结肠癌细胞株SW480、脑胶质瘤细胞株U251的杀伤率分别为42.41%±2.92%、32.27%±2.59%、36.59%±2.14%,显著高于未负载多肽对照组的杀伤率(P0.05)。结论 1.联合应用超基序法、多项式方案及量化基序法可以预测NY-ESO-1抗原表位。 2.5-Aza-CdR在体外能够诱导NY-ESO-1阴性的肿瘤细胞株重新表达NY-ESO-1。 3.DC负载HLA-A2限制性NY-ESO-1多肽后,在体外能够有效活化、扩增CTL,诱导杀伤HLA-A2和NY-ESO-1均阳性的肿瘤细胞的特异性免疫反应。 4.成功获得一条能够诱导CTL对人肝癌细胞株MHCC97-H、结肠癌株SW480及脑胶质瘤株U251均产生较强杀伤作用的NY-ESO-1多肽p86-94(RLLEFYLAM)。
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【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R392

【参考文献】