蛋氨酸亚砜还原酶A对线粒体氧化应激损伤的保护作用及基因重组Tat-hMsrA中试工艺研究

发布时间：2019-03-28 14:48

【摘要】：第一部分MsrA及其功能调节剂对线粒体氧化应激损伤的保护作用及机制目的：活性氧(ROS)的积累是细胞内关键的致病因子之一。线粒体是其中最易受氧化应激损伤的细胞器之一。蛋氨酸亚砜还原酶A(MsrA)介导的“蛋氨酸氧化-还原循环”是细胞中重要的抗氧化应激机制,具有很强的细胞保护作用。本研究探讨MsrA及其小分子功能调节剂L-蛋氨酸对过氧化氢(H202)诱导的线粒体氧化损伤的保护作用。方法：质粒构建,细胞培养,荧光成像,氧化应激造模,MTT染色,Western Blotting,电镜观察,线粒体膜电位检测,线粒体超氧化物检测。结果：荧光成像实验显示MsrA与线粒体共定位。过表达MsrA或给予L-蛋氨酸(0.5-1mM)均可减轻H202诱导的线粒体膜电位变化和超微结构变化,以及超氧化物的生成。局部预先给予L-蛋氨酸可减轻佛波酯(TPA)诱导的小鼠皮肤氧化性损伤。结论：给予参与MsrA催化抗氧化循环的小分子化合物可能是预防氧化应激损伤的新策略。第二部分MsrA及其功能调节剂对线粒体呼吸链抑制剂MPP+所致神经元凋亡的保护作用及机制目的：MsrA作为一种参与线粒体保护的重要抗氧化酶,近年来被认为和衰老相关神经系统疾病密切相关。MsrA对于Ap、缺氧和6-OHDA引起的神经细胞损伤都具有保护作用。1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPP+)是一种线粒体呼吸链阻断剂,也是最常用的建立帕金森病(PD)细胞模型的神经毒素。本研究探讨基因重组蛋白Tat-rMsrA及其小分子功能调节剂L-蛋氨酸(L-Met)、硫甲基-L-半胱氨酸(SMLC)对MPP+引起的SH-SY5Y细胞损伤的保护作用及机制。方法：SH-SY5Y细胞培养,Western Blotting,免疫组化,活性氧荧光染色,Tat-rMsrA的克隆和重组蛋白表达及纯化,MTT染色,PI染色。结果：衰老鼠中黑质、纹状体等PD相关脑区中MsrA的表达减少。基因重组蛋白Tat-rMsrA可进入SH-SY5Y细胞,并减少MPP+诱导的SH-SY5Y细胞损伤。L-Met和SMLC减少SH-SY5Y细胞中的活性氧荧光,并减轻过氧化氢和MPP+引起的SH-SY5Y细胞损伤。结论：MsrA及其功能调节剂对MPP+引起的神经细胞凋亡具有保护作用,其机制可能与其降低细胞内活性氧水平有关。第三部分基因重组Tat-hMsrA的中试工艺路线研究目的：MsrA是一种很好的抗氧化酶和蛋白修复酶,在体内扮演多种角色,与多种疾病和皮肤衰老密切相关,如：白内障、白癜风、光老化等等。MsrA可以像SOD一样添加到化妆品、保健品和药品当中,因此具有非常好的应用前景。我们合成了人源性重组蛋白Tat-hMsrA.本实验拟探讨基因重组Tat-hMsrA的中试工艺路线,为将基因重组Tat-hMsrA的产业化打下良好的基础。方法：感受肽细胞的制备和转化,基因的表达与检测,包涵体蛋白纯化及复性,亲和层析纯化,融合蛋白酶切,无his标签蛋白纯化,真核质粒的构建。结果：使用基因工程的方法构建了原核pet32a-Tat-hMsrA质粒,并从BL21(DE3),gammi, rosseta, gold筛选出最合适的宿主菌BL21(DE3),然后进行蛋白的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,发现蛋白主要在包涵体表达。然后进行蛋白的变形和复性,从包涵体得到纯化蛋白,检测后无活性。融合蛋白在上清的表达量极低,放大工艺受阻。我们转而开始构建真核酵母表达质粒ppic9k,电转化gs115宿主,进一步摸索中试工艺。结论：利用原核大肠杆菌BL21来表达人源性的重组融合蛋白Tat-hMsrA,无法进行工艺放大,因此原核发酵系统不适于Tat-hMsrA的中试放大,真核发酵系统可能较为适合。
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【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R363

【共引文献】