人CD83分子单克隆抗体与重组蛋白制备及其抑制T细胞功能的机制研究

发布时间：2019-04-03 11:26

【摘要】：人CD83分子是I型免疫球蛋白超家族(IgSF)糖蛋白,由205个氨基酸组成,分子量约45kD,包括胞外段、跨膜段和胞内段三部分,其中胞外段128个氨基酸,含一个V型Ig样功能区并被高度的糖基化;胞内段仅有39个氨基酸,且不含酪氨酸,没有相应免疫受体酪氨酸激活/抑制基序(ITAM/ITIM)。小鼠CD83全长196个氨基酸(胞外段133个),与人有63%同源性。CD83受体尚未鉴定,但可在单核细胞以及树突状细胞(DC)上检测到该潜在的未知受体表达。 CD83编码基因位于6号染色体短臂p23带。由5个外显子组成,第1个外显子编码信号肽,第2和3个编码胞外段(其中外显子3主要编码V型Ig样结构域),外显子4和5分别编码跨膜区和胞内段。序列比对表明CD83胞外段含5个半胱氨酸残基,其中第1~4个形成分子内二硫键,与蛋白构象形成有关。靠近跨膜区的第5个半胱氨酸比较保守,可通过分子间二硫键形成CD83同源二聚体。 CD83分子伴随MHC II类分子诱导表达在成熟DC表面,因此曾被认为是DC成熟的标志分子之一,但后续研究发现该分子亦可表达在活化的T与B细胞、胸腺基质细胞(TEC)以及一些肿瘤细胞表面。在中枢免疫器官胸腺中,CD83对CD4+ T细胞发育具有关键的调节作用,而在外周免疫系统中,表达在细胞表面的膜型CD83分子(membrane CD83,mCD83)的功能尚待阐明。但是非常有意义的是,大量体外实验证实从细胞表面脱落或体外重组等以可溶性形式存在CD83(solubleCD83,sCD83)对DC介导的T细胞增殖具有明显的免疫抑制作用,继而的动物体内实验也发现重组CD83蛋白对小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)以及同种异型皮肤移植急性排斥反应具有很好的预防或治疗作用。因此,sCD83发挥效应的作用模式与分子机制引起高度关注。鉴此,在本研究中,我们首先制备了人CD83-Ig重组蛋白以及鼠抗人CD83单克隆抗体,并利用重组蛋白分析了sCD83分子对T细胞的体外作用。结果表明CD83-Ig以剂量依赖方式有效抑制激发型CD3单抗刺激的外周血单个核细胞(PBMC)增殖以及IL-2与IFN-γ分泌,对纯化外周血T细胞则几乎没有作用,中文摘要人CD83分子单克隆抗体与重组蛋白制备及其抑制T细胞功能的机制研究但CD83-Ig刺激的单核细胞培养上清具有对T细胞的有效抑制效应。通过进一步对上清中的细胞因子分析和特异性抑制剂阻断实验证实,CD83-Ig与单核细胞上的未知受体结合后可介导PGE2上调表达从而发挥对T细胞的抑制效应。因此,本研究揭示了CD83分子通过上调PGE2抑制T细胞效应功能的免疫调控新机制。本论文共分为两个部分。 1.人CD83-Ig融合蛋白及鼠抗人CD83单克隆抗体的制备与生物特性鉴定采用重叠PCR(overlap extension PCR)技术构建CD83-Ig融合蛋白,包含人CD83胞外段(1~128位氨基酸)和人IgG1的Fc段。在Fc段铰链区编码序列第326位和335位有2个位点诱变(site-directed mutagenesis),使原本编码的半胱氨酸突变为丝氨酸从而阻止在铰链区形成二硫键,保持重组蛋白为单链状态。重组pIRES2-EGFP-CD83-Ig载体转染CHO细胞株后筛选获得阳性克隆1C4。无血清培养基大量培养1C4后收集上清,经Protein G亲和层析纯化获得重组蛋白。经SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色鉴定CD83-Ig分子量为54kD左右,点杂交(Dot-blot)证实重组蛋白可被特异性CD83单抗识别,而且,CD83-Ig与CD83单抗预先孵育可以剂量依赖方式阻断后者与CD83转基因细胞结合,提示该重组蛋白具有良好的生物学特性,可用于后续的功能实验。以高表达膜型CD83分子的转基因细胞株L929/CD83为免疫原,采用经典杂交瘤技术,经反复筛选及克隆化培养,获得一株稳定分泌特异性鼠抗人CD83单抗的杂交瘤细胞株,命名为1E11。快速定性试纸法分析1E11重链为IgG1,轻链为κ链。杂交瘤经体外连续传代培养,液氮冻存,复苏后生长良好,抗体分泌性能稳定。染色体数目分析显示,杂交瘤细胞株的染色体在100条以上。采用本室建立的腹水诱生法制备单抗,腹水形成阳性率约为80%以上,腹水的收获量平均为3 mL/只。经Protein G亲和层析柱分离纯化,腹水中抗体蛋白的得率为1.5~2.0 mg/mL。纯化抗体经Dot-blot鉴定表明可与重组CD83-Ig特异性结合并与商品化CD83单抗HB15e竞争结合同一表位。由此表明,1E11为特异性抗人CD83的单克隆抗体。 2. CD83-Ig刺激单核细胞分泌PGE2介导对T细胞的抑制效应 (1)体外共培养实验显示,重组CD83-Ig蛋白以剂量依赖方式抑制激发型CD3单抗诱导的PBMC增殖和IL-2与INF-γ分泌:0.5,1,2,5和10μg/mL重组CD83蛋白对PBMC增殖的抑制率分别达到84.7%,72.6%,53.7%,47.8%和43.3%;10μg/mL重组蛋白导致其IL-2分泌减少约4~5倍而IFN-γ分泌减少了60%~70%。与此形成鲜明对比的是,CD83-Ig对激发型CD3和CD28单抗联合刺激的纯化T细胞的增殖并无明显的抑制效应。(2)利用重组蛋白对未知的CD83受体表达分析表明,CD83-Ig主要结合至CD14+单核细胞却几乎不与新鲜乃至经激发型CD3和CD28刺激1到3天的T细胞结合。进一步的实验显示,可溶性CD83-Ig刺激单核细胞上清经离心去除细胞成分后用来培养激发型CD3与CD28单抗联合刺激的T细胞时,可观察到约50%的T细胞增殖抑制以及大约75%和45%的IL-2和IFN-γ分泌抑制。(3)对重组蛋白刺激的单核细胞上清分析表明在目前已知的与单核细胞有关的抑制性因子中,PGE2可被CD83-Ig介导上调表达。western blotting分析表明单核细胞内特异性催化PGE2合成的COX-2亦可被CD83-Ig介导上调表达并与PGE2分泌呈基本一致的时间动力学特点。最后,COX-2选择性抑制剂NS-398几乎完全逆转CD83-Ig介导的对PBMC的抑制效应以及CD83-Ig刺激的单核细胞上清对T细胞的抑制功能。综上所述,本研究成功地构建了重组pIRES2-EGFP-CD83-Ig载体,筛选了稳定表达人CD83-Ig蛋白CHO细胞株并制备了鼠抗人CD83单抗1E11,这为进一步探讨CD83分子表达与功能奠定了厚实的物质基础。继而的研究发现重组CD83-Ig通过刺激单核细胞分泌PGE2发挥对T细胞的免疫抑制效应。在此模式中,sCD83作为负向调控效应T细胞功能分子,在抗原递呈细胞启动的特异性免疫应答中发挥负性调控作用。本研究将为更好地理解CD83分子功能及将可溶性CD83作为生物因子用于免疫干预提供有价值的理论依据。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R392

【参考文献】