Smad2在氧糖剥夺再灌注损伤中的表达及其作用机制研究

发布时间：2019-04-17 17:41

【摘要】：研究背景及目的：转化生长因子TGF-β是一类普遍存在的细胞因子,在缺血性脑损伤中,TGF-β已被证实有神经保护作用。Smad家族是TGF-β受体的下游信号转导因子,不同Smad蛋白在神经系统疾病中发挥着不同的作用。Smad2作为TGF-β信号通路的始动效应分子,其在缺血性脑血管病中的作用机制尚不完全明了钙离子是体内重要的信号分子,病理情况下如氧化应激时细胞内钙超载可以直接激活Caspase或其他激酶诱发凋亡。既往认为高尔基体在钙离子调节上作用较小,然而最新的研究结果表明,高尔基体同样在维持胞内钙稳态中有着重要作用。分泌途径衍生钙离子转运ATP酶(Secretory-pathway Ca2+-ATPase, SPCA)是P型ATP酶(P-type ATPases)的一类亚家族,目前已知SPCA的编码基因至少有两种：ATP2C1和ATP2C2,分别编码SPCA1和SPCA2,都定位于高尔基体且SPCA1表现出的活性更强。SPCA1泵控制着高尔基体内钙离子浓度,对高尔基体内及胞浆内钙离子浓度变化有着重要意义。SPCA1在脑组织中高表达并伴随着高活性。SPCA1在神经元的发育、迁移、形态发生中起着重要作用；神经系统发育过程中SPCA1持续性高表达的区域如海马、皮质、小脑恰好是对缺血最敏感的部位,以上均提示SPCA1在维持高尔基体功能和在神经系统疾病中的重要性。目前SPCA1的研究多局限在皮肤病,关于其在脑缺血性疾病中的作用研究很少。TGF-p可以通过下调胞内钙离子浓度达到保护细胞的作用,Smad2对于SPCA1的表达及功能是否有影响,国内外尚无研究。死亡相关蛋白激酶(Death-as-sociating protein kinase, DAPK1)是一类钙离子／钙调素依赖激酶,目前认为DAPK1的主要生物学作用是参与细胞凋亡过程,在各种不同刺激下担任凋亡正向调节者的作用。 DAPK1与神经细胞的死亡密切相关,有研究表明低氧-缺血损伤动物模型中其活性升高,而DAPK1的抑制剂可以减轻缺血性脑损伤带来的打击,因此关于DAPK1在脑缺血再灌损伤中的作用正在成为目前的研究热点和药物靶点,但是国内的系统研究尚较少。Jang等发现TGF-β通过Smad2-4激活DAPK1的启动子而诱导其表达,进而促进细胞的凋亡。但是这一途径在神经细胞中是否立还未经证实。本研究的目的旨在探索Smad2蛋白在脑缺血再灌损伤中的作用,是否与调节高尔基体钙泵SPCA1的功能和DAPK1相关,探讨Smad2可能的神经保护机制。研究方法： 1.培养小鼠神经细胞瘤N2a细胞,建立氧糖剥夺再灌注模型,并采用MTT法、酶学检查、光学显微镜评价氧糖剥夺模型； 2.实验分为正常对照组、普通OGD/R组、药物干预后OGD/R组,其中普通OGD/R组、药物干预后OGD/R组按时间点不同分为1h、4h、6h三个亚组。干预药物为Smad2磷酸化抑制剂SB431542,特异性阻断Smad2活化。 3.流式细胞仪测定各组中细胞内钙离子浓度的变化以及凋亡率的变化。 4. Western blot检测各组中Smad2, p Smad2, SPCA1, DAPK1的蛋白表达变化。 5. QRT-PCR检测Smad2, SPCA1,DAPK1的基因表达水平变化。 6.酶学法测定各组中SPCA1活性的变化。 7.免疫荧光共聚焦方法观察SPCA1的细胞亚定位。结果： 1.氧糖剥夺后细胞形态变化、LDH释放量、MTT检测显示：随着氧糖剥夺时间延长,小鼠N2a细胞形态结构发生显著变化,MTT吸光度值逐渐降低,培养液中LDH释放逐渐增加；氧糖剥夺／再灌注组均较同时间点氧糖剥夺组细胞形态变化明显,LDH释放量更大,MTT吸光度值更低(P0.05),表明再灌注过程进一步降低了细胞活性,加重了细胞损伤； 2.细胞内钙离子浓度的变化：在经历氧糖剥夺／再灌注后,各组细胞内游离钙离子浓度均较正常组明显升高(P0.05),说明OGD/R诱导了细胞内钙超载。钙超载的程度与OGD持续时间相关,4h时间点的钙离子浓度值为各时间点亚组中的最高值(P0.01)。相同氧糖剥夺/再灌注时间点,药物干预组的钙超载效应更明显(P0.05)。 3. SPCA1活性的变化：在氧糖剥夺再灌注后,细胞SPCA1的酶活性较正常组显著下降(P0.05),且下降程度与OGD持续时间相关。相同OGD时间点下,药物干预后的OGD/R组酶活性较未干预组更低(P0.05)。在普通OGD/R组,三个时间点之间OGD6h/R组的酶活性最低(P0.05)；在药物干预后的OGD/R组,酶活性最低值出现在OGD4h/R组(P0.05)。经相关分析表明,钙离子浓度的变化与SPCA1酶活性的变化呈显著负相关(r=-0.722,P0.01)。 4.免疫荧光共聚焦结果：标记SPCA1的红色免疫荧光与标记GM130的绿色免疫荧光发生了明显重叠。说明SPCA1定位于高尔基体。 5. Smad2的蛋白和基因表达变化：经历OGD/R之后,各组的Smad2的蛋白和基因表达水平均高于正常组,且与OGD的持续时间相关,说明氧糖剥夺再灌注能上调Smad2的表达。在普通OGD/R组中,4h时间点Smad2的蛋白和基因表达水平为峰值(P0.05)；磷酸化pSmad2的表达趋势与Smad2一致。在药物干预后,各时间点的Smad2蛋白表达均出现明显下降(P0.05),表明药物成功抑制了磷酸化pSmad2的表达,从而使总Smad2的蛋白水平下降；同时在基因水平也出现了有趣的变化,1h时间点Smad2的表达水平要高于普通OGD/R组,而4h及6h时间点Smad2的表达水平却低于普通OGD/R组,6h时间点的蛋白和基因表达水平为最低值(P0.05)。 6. SPCA1的蛋白和基因表达变化：氧糖剥夺再灌注之后,SPCA1的蛋白和mRNA水平较正常组明显下降(P0.05),与OGD持续时间呈相关性。在普通OGD/R组,1h和4h时间点的SPCA1蛋白呈持续低表达水平,6h时间点表达出现上调(P0.05)；药物干预后的OGD/R组也出现了同样的趋势(P0.01)。mRNA的变化趋势与蛋白水平一致。我们进一步比较了同时间点下抑制Smad2的活性对于SPCA1表达的影响。我们发现,只有在6h时间点,两组出现了表达差异,药物干预组的SPCA1蛋白和基因表达水平较普通OGD/R组升高(P0.05)。 7. DAPK1的蛋白和基因表达变化：氧糖剥夺再灌注之后,DAPK1的蛋白和基因表达水平较正常组上调(P0.05)；且与氧糖剥夺的持续时间相关。4h时间点的表达水平最高(P0.05)。药物阻断Smad2活化使DAPK1的表达进一步上调(P0.05)。 8.细胞凋亡率的变化：氧糖剥夺再灌注过程诱发了细胞的凋亡,与正常对照组有明显差异(P0.05)；凋亡率与OGD的持续时间相关,4h组的凋亡率最高(P0.01)。药物干预使凋亡率较同时间点普通OGD/R组明显上升(P0.05),说明阻断Smad2的活化加重了细胞的凋亡损伤。结论： 1. Smad2的表达水平受氧糖剥夺再灌注的调节。阻断Smad2的活化加重了细胞内钙超载的程度和凋亡率；Smad2有神经保护作用。 2.氧糖剥夺再灌注抑制SPCA1的功能活性,下调蛋白和基因表达水平。SPCA1功能受损参与导致了细胞内钙超载； 3. DAPK1的表达水平受氧糖剥夺再灌注的调节； 4. Smad2在氧糖剥夺再灌注中的作用与调节细胞内钙离子稳态密切相关。其机制可能与调节SPCA1的表达及功能、以及调节DAPK1的表达有关。
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【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R363

【参考文献】