仿生理状态组织工程角膜上皮、基质层的构建

发布时间：2019-04-24 06:13

【摘要】：目的：(1)探讨C02激光打标机处理的有序排列微模板培养兔角膜基质细胞的生长特征及其细胞生物学变化。(2)探索角膜上皮、口腔黏膜上皮细胞在UpCellTM温敏型表面培养皿上的合适接种密度及生长特性,利用温敏特性获得无载体细胞片以及构建口腔黏膜上皮细胞片的意义。(3)探讨重组Maxadilan(MAX)对角膜基质微环境下培养的口腔黏膜上皮细胞的CK3表达的影响；不同浓度的MAX对角膜基质细胞的影响。方法：(1)用CO2激光打标机刻制的聚苯乙烯有序排列微模板培养兔角膜基质细胞,模板沟槽划线间隔距离0.25mmm者为窄间隔组,间隔距离1mm者为宽间隔组,平板组作为对照组。将角膜基质细胞悬液1×105/ml细胞密度接种于培养板,倒置显微镜下每日观察细胞生长情况、HE染色观察细胞排列的形态学差异、免疫荧光法检测培养板上细胞的波形蛋白、实时监测显微镜下观察24h窄间隔组细胞的接触指引特性及细胞的动态生长过程。(2) UpCellTM温敏型表面培养皿及普通培养皿上接种不同密度的原代兔角膜上皮、口腔黏膜上皮细胞,置于37℃,5％CO2培养箱培养。通过倒置显微镜观察两种细胞在温敏培养皿上生长状况、形态学差异,同时寻求合适的接种密度；吖啶橙染色显示即将获取细胞片的活性；获取细胞片后石蜡切片HE染色以及扫描电镜观察细胞片的结构。(3)用RT-PCR检测PAC1受体在角膜基质细胞中的表达情况；Western-Blot检测PACl受体在角膜上皮细胞、角膜基质细胞及口腔粘膜上皮细胞中的表达检测；采用普通培养法及24h饥饿法分别添加不同浓度的MAX,培养兔角膜基质细胞,运用CCK8检测MAX对角膜基质细胞的促增殖作用；用免疫荧光定量Real-TimePCR检测以下4组细胞角蛋白CK3的表达差异：第一组,口腔黏膜上皮细胞+角膜基质细胞(通过插入式培养皿)。第二组,口腔黏膜上皮细胞+角膜基质细胞+100nM MAX。第三组,单纯口腔黏膜上皮细胞。第四组,单纯角膜上皮细胞。结果：(1)培养第1天倒置显微镜下见角膜基质细胞贴壁生长,窄间隔组和宽间隔组细胞逐渐围绕沟槽接触指引生长,表现为有序排列,且窄间隔组较宽间隔组明显。HE染色与免疫荧光染色显示培养细胞在窄间隔组沟槽的接触指引下呈有序排列,呈现10余层细胞排列的平行板层结构。3组细胞波形蛋白免疫荧光染色均呈阳性反应。实时监测显微镜下可见窄宽间隔组细胞体部首先贴壁,在接触指引下生长,而细胞在干燥环境下的凋亡始于细胞伪足突起处。(2)不同密度接种于UpCellTM温敏型表面培养皿及普通培养皿中的原代兔角膜上皮、口腔黏膜上皮细胞,早期没有表现出形态学上的差别,且在温敏型表面培养皿及普通培养皿中生长状况一致。随时间延长5×104/ml密度细胞生长缓慢,2×105/ml密度的细胞容易出现凋亡态,1×105/ml密度接种细胞出现铺路石状细胞,有较多细胞克隆中心形成,细胞呈复层,8天后生长状态最佳。20℃-25℃低温培养后见培养皿的局部有细胞片脱离温敏材料的表面,呈卷曲状,随时间延长发现脱离的细胞片越来越大,石蜡切片HE染色细胞呈复层,扫描电镜观察细胞片细胞间交错连接明显,排列紧密。(3)RT-PCR证实角膜基质细胞上有PAC1受体的表达,Western-Blot证实角膜上皮细胞、角膜基质细胞及口腔黏膜上皮细胞上PAC1受体的表达阳性；CCK8细胞增殖实验显示MAX对角膜基质细胞有促进作用；Real-Time PCR证实MAX促进与角膜基质细胞共培养的口腔黏膜上皮细胞的CK3表达。结论：(1)利用CO2激光打标机制备的有序排列微模板可获得有序排列角膜基质细胞,有利于在接近于生理状态条件下角膜基质层的构建。(2)UpCellTM温敏型表面培养皿获取无载体细胞片,符合构建生理状态的角膜上皮层的要求。(3)角膜上皮细胞、角膜基质细胞及口腔黏膜上皮细胞均表达]PAC1受体；PAC1受体激动剂Maxadilan对角膜基质细胞具有促增殖作用,并促进口腔黏膜上皮细胞CK3的表达,Maxadilan有利于组织工程角膜种子细胞的生长。
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【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R314

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