P53结合位点对NOD8基因的调控研究

发布时间：2019-05-09 08:57

【摘要】：目的： 本研究观察含有/缺失人p53结合位点的NOD8基因启动子驱动的绿色荧光蛋白表达载体在HEK293细胞的表达以及含有/缺失人p53结合位点的NOD8基因启动子驱动的绿色荧光蛋白-NOD8融合蛋白重组质粒[pNOD8(760bp)-EGFP-NOD8和mpNOD8(750bp)-EGFP-NOD8]转染HEK293细胞后, NOD8mRNA和蛋白的表达；并进一步观察p53抑制剂PFT-α (pifithrinalpha, PFT-α)对绿色荧光蛋白及NOD8表达的影响,探讨p53结合位点是否在NOD8基因调控中发挥作用。 方法： 利用生物信息学方法，我们发现人与黑猩猩的NOD8基因核心启动子区域相似位置含有p53结合位点。本研究将含有人p53结合位点的人NOD8基因启动子驱动的绿色荧光蛋白载体pNOD8(760bp)-EGFP及p53结合位点缺失突变质粒mpNOD8(750bp)-EGFP转染HEK293细胞，在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白；并加入不同浓度的p53抑制剂PFT-α处理HEK293细胞24h后，将重组质粒pNOD8(760bp)-EGFP瞬时转染HEK293细胞，观察绿色荧光蛋白的表达情况。同时，将含有/缺失人P53结合位点的NOD8基因启动子驱动的表达绿色荧光蛋白-NOD8融合蛋白的质粒[pNOD8(760bp)-EGFP-NOD8和mpNOD8(750bp)-EGFP-NOD8]经阳离子聚合物JetPeiT M介导瞬时转染HEK293细胞，并在转染pNOD8(760bp)-EGFP-NOD8质粒的细胞中加入不同浓度的p53抑制剂PFT-α，mpNOD8(750bp)-EGFP-NOD8质粒转染组加入90μmol/L的p53抑制剂PFT-α,用RT-PCR和Westren blot方法检测NOD8mRNA和蛋白的表达；此外，利用染色质免疫共沉淀法（chromatin immunoprecipitation, ChIP）观察p53是否与NOD8启动子结合。 结果: p53结合位点突变重组质粒在HEK293细胞中绿色荧光表达较p53结合位点未突变的重组质粒明显减弱; PFT-α能够抑制pNOD8(760bp)-EGFP质粒在细胞内的绿色荧光表达,且呈现剂量依赖性效应；ChIP实验证实p53能与NOD8启动子结合；pNOD8(760bp)-EGFP-NOD8转染组的NOD8mRNA表达显著高于pEGFP-C2转染组（P＜0.05）。且NOD8mRNA在加入p53抑制剂PFT-α的缺失人的p53结合位点的mpNOD8(750bp)-EGFP-NOD8转染组的表达显著降低（P＜0.01）；同时发现加入p53抑制剂PFT-α的pNOD8(760bp)-EGFP-NOD8转染组NOD8mRNA表达显著下降，且呈剂量依赖关系，其中90μmol/L PFT-α对NOD8mRNA表达的抑制作用是最为显著的（P＜0.01）。与mRNA检测结果一致，pNOD8(760bp)-EGFP-NOD8转染组的NOD8蛋白的表达量显著高于对照组pEGFP-C2；加入p53抑制剂PFT-α的mpNOD8(750bp)-EGFP-NOD8转染组和加入p53抑制剂PFT-α的pNOD8(760bp)-EGFP-NOD8转染组NOD8蛋白的表达量明显低于pNOD8(760bp)-EGFP-NOD8转染组（P＜0.01）。结论:(1)p53结合位点突变重组质粒在HEK293细胞中绿色荧光表达较P53结合位点未突变的重 组质粒明显减弱；说明p53结合位点能影响NOD8基因启动子的启动效率。(2)PFT-α能够抑制重组质粒pNOD8(760bp)-EGFP在HEK293细胞内绿色荧光蛋白表达，且呈 现剂量依赖性；(3)ChIP实验证实p53能与NOD8启动子结合。(4)NOD8启动子中p53结合位点具有上调NOD8mRNA和蛋白表达的作用，，说明p53结合位 点在NOD8基因调控中发挥了正调节作用。
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【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R346

【参考文献】

相关期刊论文 前3条

1 孙丽萍;胡巢凤;;NOD突变在遗传性疾病中的作用[J];第四军医大学学报;2008年02期

2 曾琪;蒋宇;胡巢凤;孙丽萍;陆大祥;;P53结合位点在NOD8启动子基因克隆调节及其对NOD8基因中的作用[J];现代免疫学;2010年06期

3 席琼;胡巢凤;;NOD样受体在炎症反应中的调控作用[J];生命科学;2010年05期

本文编号：2472642