IL-1β对体外海马神经干细胞增殖及分化的影响

发布时间：2019-05-14 17:42

【摘要】：背景和目的抑郁的发病机制尚不清楚,关于抑郁的病因也有很多种理论假说,其中海马神经元的损伤和再生障碍在抑郁的发病过程中越来越受重视。海马是大脑中神经元可再生的重要区域之一,海马中的神经干细胞(Neural stem cells, NSCs)是神经元的前体细胞,对于神经元的数量再生与维持有重要影响。体外实验表明炎性细胞因子白介素-1β(interleukin-1 beta,IL-1β)能抑制海马神经祖细胞的增殖,因此,研究IL-1β在抑郁症发病过程中的作用和机制,不仅有利于揭示抑郁症的发病机制,也将为开发新型抗抑郁药物提供新的靶点。本课题组前期的研究成果证明:腹腔注射脂多糖、腹腔注射利血平均可引起大鼠的行为性抑郁,同时脑内不同区域的细胞因子IL-1β的升高,脑内注射IL-1β受体拮抗剂可以部分改善这种行为性抑郁,给予腺苷受体拮抗剂咖啡因和A2A受体拮抗剂可以部分逆转这种行为性抑郁;脑室内注射IL-1β可以诱导大鼠的行为性抑郁;体外IL-1β能剂量依赖性的抑制海马神经元的活性,降低BDNF表达,CREB-BDNF通路可能在其中有着至关重要的作用,NMDAR可能参与其中。上述研究表明IL-1β与行为性抑郁有着密切的关系,关于其分子生物学机制可能与抑制脑源性神经生长因子龴BDNF)的表达降低有关。本实验拟进一步探究IL-1β对于神经元的前体细胞-神经干细胞活性的影响及其机制,并研究A_(2A)受体及NMDA受体在其中的作用,以及IL-1β对于神经干细胞分化成神经元和星形胶质细胞的影响。材料和方法 1.海马神经干细胞的培养、鉴定 24h内SD大鼠新生鼠3-4只,断头取脑,分离两侧海马,机械吹打成为单细胞悬液,加入含10%FBS的DMEM/F12培养液,置入37℃、5%CO_2培养箱30min,去除为成纤维细胞,24h后弃掉上清液,重新加入含10%FBS的DMEM/F12新鲜培养液培养72h,离心弃掉上清液,换用神经干细胞培养液(含2% B27、20ng/ml bFGF及20ng/ml EGF的DMEM/F12培养液),3-4天换液,7-8天传代一次。连续纯化培养约21天,以作实验用材。神经干细胞高度选择性单克隆抗体Nestin (巢蛋白)行免疫细胞化学龴immunocytochemistry, ICC)鉴定。 2. IL-1β对神经干细胞增殖的影响及机制以IL-1β孵育神经干细胞3天换液并取出一半细胞,测细胞活性。剩余细胞再补足新鲜培养液及药物继续孵育3天取出全部的细胞,MTT法测细胞活性。以不同浓度的IL-1β孵育神经干细胞3天,收集上清液以ELISA试剂盒测其上清液中的BDNF浓度。以10ng/ml IL-1β孵育神经干细胞,同时加入NMDA受体拮抗剂MK-801或者A_(2A)受体拮抗剂MSX-3,共同孵育3天,取出全部的细胞,MTT法测细胞活性。 3.咖啡因及NGF对神经干细胞增殖的影响以咖啡因,NGF孵育神经干细胞3天,换液并取出一半细胞,测细胞活性。剩余细胞再补足新鲜培养液及药物,继续孵育3天取出全部的细胞,MTT法测细胞活性。 4. IL-1β对神经干细胞分化成星形胶质细胞和神经元的影响多聚赖氨酸铺板,调整神经干细胞的密度,10%FBS+正常神经干细胞培养液加入不同实验浓度IL-1β(0、5、10、20)ng/ml分化3天,换液继续分化培养,共6天,去除上清液,分别用GFAP和β-TubulinⅢ行荧光免疫细胞化学染色计数以及用流式细胞仪检测星形胶质细胞和神经元的比例。 5.统计方法应用Excel 2003和SPSS17.0统计软件进行统计分析。结果以均数±标准差((x|-)±SD)表示,采用方差分析进行比较,以P=0.05为差异具有统计学意义,P=0.01为差异具有高度统计学意义。结果第一部分IL-1β对海马神经干细胞活性的影响及其机制 1.神经干细胞培养、形态学观察、鉴定机械吹打后神经干细胞培养液初始为单细胞悬液,24h后见到上清液中漂浮有大量组织残块,难于观察神经球,弃去大部分上清液,补充新鲜的含10%FBS的DMEM/F12培养液,24h后视野中即出现约4-8个细胞构成的克隆球,细胞持续分裂增殖,第四天时换液,换用神经干细胞培养液,此时细胞克隆球的直径约为50um-100um。第七天时,细胞形成的克隆球直径约为100-200um。胰酶消化3-5min,用含10%FBS的DMEM/F12培养液等体积终止消化,PBS冲洗细胞两遍,玻璃吸管机械吹打成单细胞或较小的细胞团,加入新鲜的神经干细胞培养液,细胞会按照同样的规律再次分裂增殖形成克隆球。大约21天后第三代神经干细胞可作为试验用材。多聚赖氨酸铺培养板,去离子水冲洗2次,神经干细胞贴壁24小时后,用巢蛋白(Nestin)行免疫细胞化学染色,可见到克隆球整体着色,视野中所有细胞球全部成阳性反应。 2. IL-1β降低神经干细胞活性 IL-1β(0、5、10、20)ng/ml孵育海马神经干细胞,孵育3天取出一半细胞MTT法测细胞活性,剩余的细胞补足新鲜培养液,IL-1β加至原实验浓度继续培养3天,取出剩余的全部细胞,以同样的方法测细胞活性。结果显示:以浓度(0、5、10、20)ng/ml的IL-1β孵育海马神经干细胞,孵育3天检测细胞活性的OD值分别为(0.511±0.054,0.425±0.053,0.394±0.033和0.380±0.052),与0ng/ml组相比较,(5、10、20)ng/ml的IL-1β能降低神经干细胞,差异具有统计学意义(分别为P0.05,P0.01,P0.01,ANOVA);孵育6天检测细胞活性的OD值分别为0.453±0.075,0.366±0.072,0.339±0.038和0.330±0.059),与0ng/ml组相比较, (5、10、20)ng/ml组差异具有统计学意义(分别为P0.05,P0.01, P0.01,ANOVA)。结果表明,以不同浓度的IL-1β孵育海马神经干细胞3天或6天,均可剂量依赖性的降低海马神经干细胞的活性。 3. NMDA受体拮抗剂反转IL-1β对神经干细胞活性的抑制作用选择10ng/ml浓度的IL-1β孵育海马神经干细胞3天,同时加入不同浓度的NMDA受体拮抗剂MK-801(0,2.5,5,10,20,40)um/ml,同时设无IL-1β和MK-801的对照组,MTT法检测细胞活性。结果表明:与对照组OD值(0.486±0.078)相比,IL-1β10ng/ml(0.343±0.054)可降低神经干细胞活性,差异有高度统计学意义(P0.01);不同浓度(0,2.5,5,10,20,40)um/ml的MK-801与IL-1β(10ng/ml)共同孵育干细胞,其活性检测的OD值分别是(0.343±0.054,0.411±0.035,0.443±0.117,0.543±0.089,0.511±0.038和0.509±0.028)。当MK-801浓度为(5,10,20,40)um/ml时,可反转IL-1β对神经干细胞的活性抑制作用,差异有统计学意义(P0.05,P0.01, P0.01, P0.01,ANOVA)。 4. A_(2A)受体拮抗剂对IL-1β抑制干细胞活性作用的影响选择10ng/ml浓度的IL-1β孵育海马神经干细胞3天,同时加入不同浓度的腺苷A_(2A)受体拮抗剂MSX-3(0,125,250,500,1000, 2000)ng/ml,同时设无IL-1β和MSX-3的对照组,MTT法检测细胞活性。与对照组OD值(0.612±0.213)相比,IL-1β10ng/ml、MSX-3(0ng/ml)组(0.397±0.047)神经干细胞活性显著降低,差异有高度统计学意义(P0.01);不同浓度的腺苷A_(2A)受体拮抗剂MSX-3(0,125,250,500,1000, 2000ng/ml)与IL-1β10ng/ml共同孵育干细胞,其活性检测的OD值分别是:(0.397±0.047,0.453±0.020,0.476±0.068,0.557±0.049,0.456±0.064和0.435±0.129)。结果表明,当A_(2A)受体拮抗剂MSX-3浓度为500ng/ml时可反转IL-1β对神经干细胞的活性抑制作用(P0.05) ,其它浓度的MSX-3均无显著性作用(P0.05,ANOVA)。 5. IL-1β抑制海马神经干细胞释放BDNF 以IL-1β(0、5、10、20)ng/ml孵育海马神经干细胞3天,Elisa试剂盒法检测上清液中的BDNF浓度,结果显示:与对照0ng/ml组(14.179±2.021)pg/ml相比较,各加药组上清液中BDNF的浓度分别为(10.346±1.377)pg/ml, (9.013±1.250)pg/ml, (2.429±0.382)pg/ml,含量显著减少,差异具有统计学意义(P0.05,P0.01, P0.01,ANOVA)。第二部分IL-1β对神经干细胞分化的影响 1. IL-1β对于神经干细胞分化成星形胶质细胞的影响经胰酶消化和机械吹打,将神经干细胞球制成单细胞悬液,以含10%FBS的神经干细胞培养液重悬细胞。以5×104/ml的细胞浓度铺96孔板分化,用免疫细胞化学染色;以50×104/ml的细胞浓度培养细胞铺12孔板分化,用于流式细胞术检测。培养体系中分别加入不同浓度的IL-1β(0、5、10、20)ng/ml,分化6天后以兔抗大鼠GFAP进行免疫细胞化学染色和流式细胞术计数星形胶质细胞的比例。免疫细胞化学染色结果表明IL-1β10ng/ml(83.207%±0.008)与IL-1β0ng/ml(77.620%±0.029)相比较,差异具有统计学意义(P0.05),IL-1β20ng/ml (88.096%±0.020)与IL-1β0ng/ml相比较,差异具有高度统计学意义(P0.01), IL-1β5ng/ml(79.989%±0.048)与IL-1β0ng/ml组相比较,差异没有统计学意义(P0.05)。IL-1β各剂量组间比较,除IL-1β20ng/ml(88.096%±0.020)与IL-1β10ng/ml(83.207%±0.008)组相比较,差异有统计学意义(P0.05),其余组间差异无显著性(P0.05)。结果表明:IL-1β可以剂量依赖性的提高神经干细胞向星形胶质细胞分化的比例。流式细胞仪计数结果与免疫细胞化学染色结果大体一致:与对照组IL-1β0ng/ml组(78.550%±0.018)相比较,IL-1β10 ng/ml组(82.447%±0.005)与IL-1β20 ng/ml组(84.847%±0.012)差异具有高度统计学意义(P0.01, P0.01),IL-1β5 ng/ml组(78.863%±0.005)与对照组IL-1β0 ng/ml组(78.550%±0.018)相比较,差异无统计学意义。IL-1β10 ng/ml组(82.447%±0.005)及IL-1β20 ng/ml组(84.847%±0.012)与IL-1β5 ng/ml组(78.863%±0.005)相比较差异具有高度统计学意义(P0.01, P0.01),IL-1β20 ng/ml组(84.847%±0.012)与IL-1β10 ng/ml组(82.447%±0.005)相比较差异具有统计学意义(P0.05)。 2. IL-1β对于神经干细胞分化成神经元的影响经胰酶消化和机械吹打,将神经干细胞球制成单细胞悬液,以含10%FBS的神经干细胞培养液重悬细胞。以5×10~4/ml的细胞浓度铺96孔板分化,分别加入不同浓度的IL-1β(0、5、10、20)ng/ml,培养6天后进行免疫细胞化学染色,以β-TubulinⅢ标记神经元,计数神经元的比例。结果显示:与对照组IL-1β0 ng/ml(11.486%±0.032)组相比较,IL-1β(5、10、20)ng/ml组神经元的比例为(9.202%±0.025,9.922%±0.025,9.564%±0.014),差异均无统计学意义。结果表明,IL-1β对体外培养的海马神经干细胞分化成神经元没有直接的作用。第三部分咖啡因与NGF对神经干细胞增殖的影响 1.咖啡因对体外神经干细胞活性的影响本课题组前期实验结果表明:腺苷受体拮抗剂咖啡因和A_(2A)受体拮抗剂可以部分逆转IL-1β所致的行为性抑郁,说明咖啡因对于IL-1β的影响有一定的反转作用,但体外实验证明咖啡因直接对于神经元的活性造成抑制作用,未能反转IL-1β对于海马神经元的损伤。为进一步明确咖啡因对于体外培养神经干细胞的增殖的影响及咖啡因作为腺苷受体阻断剂是否参与IL-1β介导的神经损伤作用。咖啡因(0,0.1,1,10)mM/ml孵育神经干细胞3天取出一半细胞MTT法测活性,剩余细胞如上所述补足新鲜培养液及咖啡因继续培养,孵育6天后取出剩余全部细胞,同样的方法测活性。结果显示:孵育3天,咖啡因0.1mM/ml组OD值为(0.173±0.034)与0mM/ml组(0.211±0.039)相比,差异无统计学意义(P0.05);咖啡因(1,10)mM/ml组OD值分别为(0.163±0.033,0.142±0.026)与0mM/ml组相比,差异具有统计学意义(P0.05,P0.01,ANOVA)。孵育6天咖啡因浓度为0.1mM/ml的OD值为(0.167±0.023)与0mM/ml组(0.189±0.031)相比,差异无统计学意义(P0.05);咖啡因浓度为(1,10)mM/ml组OD值为(0.156±0.022,0.129±0.023)与0mM/ml组相比,差异具有统计学意义(P0.05,P0.01,ANOVA)。结果提示:咖啡因可剂量依赖性地降低体外培养的海马神经干细胞的活性。 2. NGF对体外神经干细胞活性的影响 NGF和BDNF同属于神经营养因子,在中枢神经系统广泛存在。对于神经系统维持正常发育和功能非常重要。要使神经干细胞要进行分化获得尽可能多的神经元,必须有足够的神经干细胞储备。模拟体内环境,检测NGF能否促进神经干细胞增殖。 NGF(0,20,50)ng/ml孵育神经干细胞,孵育3天取出一半细胞MTT法测活性,补足新鲜培养液继续培养。孵育6天取出剩余全部细胞,同样的方法测活性。结果表明:孵育3天NGF 20ng/ml组OD值(0.204±0.055)与0ng/ml组(0.162±0.030)相比较,差异无统计学意义(P0.05);NGF50ng/ml组OD值(0.240±0.068)与0ng/ml相比较,差异具有统计学意义(P0.05,ANOVA)。孵育6天时NGF 20ng/ml组OD值(0.163±0.037)与0ng/ml组(0.142±0.041)相比较,差异无统计学意义(P0.05);NGF50ng/ml组OD值(0.183±0.045)与0ng/ml组相比较,差异有统计学意义(P0.05,ANOVA)。结果提示:NGF能促进海马神经干细胞的增殖活性。结论 1. IL-1β降低体外培养的海马神经干细胞的增殖活性,其机制可能与BDNF含量释放减少有关,NMDA系统和腺苷系统可能参与其中。 2. IL-1β促进神经干细胞向星形胶质细胞方向分化,但对神经元的分化没有影响。 3.咖啡因体外能抑制海马神经干细胞的增殖活性,NGF能促进海马神经干细胞的增殖活性。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：汕头大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R329

【参考文献】