HSPA1A启动子荧光素酶报告基因HepG2细胞体系的建立和在环境污染物毒性评估中的应用

发布时间：2019-05-19 06:33

【摘要】：近年来,随着社会经济的飞速发展,环境污染问题也日益突出。环境污染严重威胁着人类的身体健康,而且已成为21世纪社会发展所面临的重大公共卫生问题之一。环境污染主要包括大气污染、水体污染和土壤污染,其中对人类健康影响最直接和最严重的是空气污染。空气污染物主要包括以单一化学物质形式存在的烃类和甲醛等气态污染物和以复合物形式存在的总悬浮颗粒物等大气颗粒污染物。空气污染物主要通过呼吸道等途径进入机体,与人类的呼吸和心血管等系统疾病的发生密切相关。在环境污染物对人类健康效应的研究中,毒性评估是最常用和最有效的手段之一。目前常用的测定细胞存活率、氧化损伤和遗传损伤等细胞损伤水平的毒性评估实验耗时长、操作复杂,且仅能分析环境污染物对细胞或生物体的某一类毒性效应。因此,亟须建立一种操作简便、成本较低的毒性评估方法来综合评价空气中的单一和复合化学污染物的各种毒性。近年来,基于细胞应激基因启动子调控的荧光素酶报告基因实验已成为最具有潜力的毒性评估方法之一。热休克反应(Heat Shock Response, HSR)是以热休克蛋白(Heat Shock Proteins, HSPs)的诱导合成为主要特征的细胞应激反应。在众多的HSPs家族中,最为重要的是由HSPA1A基因编码HSPA1A(Hsp70-1)蛋白。HSPA1A通常参与蛋白质的合成和折叠,错误折叠蛋白质的正确折叠和降解。当细胞受到各种应激因素,如高温、重金属和化学毒物等作用后,胞质中的热休克因子Heat Shock Factor, HSF)被激活并进入细胞核与位于HSPA1A启动子区域的热休克元件(heat shock element, HSE)结合,激活HSPA1A基因的转录,启动HSPA1A蛋白的表达。由于该基因对各种环境应激因素十分敏感,HSPA1A基因的表达逐渐成为环境污染物对细胞或生物体早期毒性效应的一种敏感的标志物。目前,基于HSPA1A基因启动子调控的荧光素酶报告基因实验已成为常用的环境污染物毒性评估方法之一。尽管有研究者选用了HSPA1A启动子调控的荧光素酶报告基因细胞体系来评估重金属、有机氯化合物、城市废水等水体和土壤污染物的毒性,但是,利用HSPA1A启动子荧光素酶报告基因技术来评估多环芳烃、甲醛、汽车尾气和焦炉逸散物等单一和复合空气污染物的毒性的研究鲜有报道。基于上述研究,本研究拟构建稳定转染HSPA1A启动子调控的荧光素酶报告基因质粒的HepG2细胞体系(HepG2/HSAPA1A细胞),并用该细胞来综合评价空气中常见的单一和复合化学污染物的毒性。芘、苯并[a]芘、甲醛、汽车尾气和焦炉逸散物等环境污染物作用HepG2/HSAPA1A细胞后,分别测定细胞的荧光素酶活性、存活率、细胞培养上清液中的丙二醛(MDA)浓度、细胞的DNA损伤水平和微核率,并将HepG2HSPA1A细胞体系与细胞存活率实验、MDA实验、单细胞凝胶电泳和微核实验分别进行比较来评价HepG2/HSPA1A细胞体系在化学污染物的综合毒性评估中的应用和该细胞体系的敏感性。本研究的假设是HepG2/HSPA1A细胞体系的荧光素酶活性可以敏感地反映环境污染物对细胞的综合毒性效应。本研究共分为三部分：第一部分HSPA1A启动子荧光素酶报告基因HepG2细胞体系(HepG1/HSPA1A细胞)的建立本研究运用脂质体转染技术来构建HSPA1A启动子荧光素酶报告基因HepG2细胞体系(HepG2/HSAPA1A细胞)。首先,我们构建了pGL4.17/HSPA1A重组质粒,然后将经酶切和测序鉴定的重组质粒转染入HepG2细胞中,并用G418筛选稳定转染的HepG2/HSPA1A细胞。最后,我们对HepG2/HSAPA1A细胞体系进行鉴定。分别用Western blotting实验和Luciferase assay system试剂盒测定42℃热休克1h后37℃恢复不同时间的HepG2/HSAPA1A细胞的HSPA1A的表达水平和荧光素酶活性。Western blotting结果显示,与未热休克对照组相比,热休克后HepG2/HSPA1A细胞的HSPA1A的表达水平升高,且在恢复培养4h后达到峰值,随后下降。3次独立实验分析结果显示,恢复培养4h后HSPA1A的表达水平是对照组的3倍。与对照组相比,热休克后细胞的相对荧光素酶活性均显著增加(P0.01),且与HSPA1A的表达水平呈相似的变化趋势。热休克恢复培养4h后细胞的相对荧光素酶活性达到峰值,为对照组的9倍。Spearman相关性分析结果显示HSPA1A的表达水平与细胞的相对荧光素酶活性呈显著正相关。热休克是经典的引起热休克反应的应激条件。热休克后,HepG2/HSPA1A细胞体系的HSPA1A的表达水平明显升高,HSPA1A基因的启动子也增强了转录,这些研究结果表明HepG2/HSPA1A细胞体系已构建成功,且该细胞体系可以用于敏感地评估环境应激因素对细胞的早期毒性效应。第二部分HepG2/HSPA1A细胞体系在评价空气中单一化学污染物毒性中的应用为了研究HepG2/HSPA1A细胞体系在空气中单一化学污染物毒性评估中的应用,我们用空气中常见的三种单一化学污染物(非致癌性多环芳烃芘、致癌性多环芳烃苯并[a]芘和致突变剂甲醛)作用HepG2/HSPA1A细胞24h后,分别测定细胞的相对荧光素酶活性、细胞存活率、氧化损伤水平(MDA浓度)和遗传损伤水平(Olive TM值和微核率)。研究结果显示,芘染毒后,HepG2/HSPA1A细胞的相对荧光素酶活性随着染毒剂量的增加而逐渐增加,与对照相比,差异具有统计学意义(P0.05)。在最高染毒剂量下(100μM),细胞的相对荧光素酶活性为对照组的2.4倍。不同浓度的苯并[a]芘染毒HepG2/HSPA1A细胞后,细胞的相对荧光素酶活性均显著增加。在染毒20μM时,细胞的相对荧光素酶活性是对照组的2.7倍。较低剂量的甲醛(1μM)也能显著增加细胞的相对荧光素酶活性,且在最高染毒剂量(40μM)下,细胞的相对荧光素酶活性为对照组的1.6倍。芘染毒后,细胞的相对荧光素酶活性仅与MDA浓度呈显著正相关(P0.01)。苯并[a]芘和甲醛染毒后,细胞的相对荧光素酶活性与Olive TM值及细胞微核率均呈显著正相关(P0.01)。引起细胞的相对荧光素酶活性显著增加所需的芘、苯并[a]芘和甲醛的剂量是等于或低于细胞存活率显著降低、MDA浓度显著增加、细胞Olive TM值和微核率显著增加所需的最低剂量。这些研究结果表明Hep2/HSPA1A细胞的荧光素酶活性不仅可以作为单一化学污染物所诱导的细胞早期损伤的一个敏感的指标,而且可以综合反映单一化学污染物所诱导的细胞氧化损伤和遗传损伤等毒性效应。HepG2/HSPA1A细胞体系可以用于评估空气中单一化学污染物的综合毒性。第三部分HepG2/HSPA1A细胞体系在评价空气中复合化学污染物毒性中的应用在研究了HepG2/HSPA1A细胞体系在单一化学污染物毒性评估中的应用之后,本部分将进一步探讨该细胞体系是否可以用于评估空气中的复合化学污染物的毒性。汽车尾气是人类生活环境中的污染物的一个重要来源,大多数个体每天都会暴露于一定量的汽车尾气。焦炉逸散物是燃煤型污染物的代表,其中含有大量的致癌性有毒物质,严重威胁着作业工人的身体健康。故本部分我们选择在交通拥挤的街道及焦化厂工人不同作业区分别采集空气样本,并研究这些空气样本对HepG2/HSPA1A细胞的各种毒性效应。结果显示,不同浓度的汽车尾气作用细胞后,细胞的相对荧光素酶活性均显著增加。且在0.6ng/l的剂量作用下,细胞的相对荧光素酶活性是对照组的1.4倍。在最低染毒剂量(6pg/l)作用下,细胞的相对荧光素酶活性与对照组相比,差异仍有统计学意义(P0.01)。炉底焦炉逸散物染毒细胞组的相对荧光素酶活性显著增加,与对照组相比,差异均有统计学意义(P0.01)。且在0.15μg/l的剂量作用下,细胞的相对荧光素酶活性最高,为对照组的1.4倍。细胞的相对荧光素酶活性随着炉侧和炉顶焦炉逸散物浓度的增加而逐渐增加,差异均有统计学意义(P0.01)。在炉侧和炉顶焦炉逸散物染毒最高浓度时(65.4μg/l,202μg/l),细胞的相对荧光素酶活性分别为对照组的2.1和5.3倍。汽车尾气样本作用后,细胞的相对荧光素酶活性与Olive TM值及细胞微核率均呈显著正相关(P0.01)。炉底焦炉逸散物作用后细胞的相对荧光素酶活性与MDA浓度呈显著正相关,差异有统计学意义(r=0.404,P0.05)。炉底、炉侧和炉顶焦炉逸散物染毒后,HepG2/HSPA1A细胞的相对荧光素酶活性均与Olive TM值、细胞微核率呈显著正相关(P0.05)。在低剂量的汽车尾气(0.006ng/l)和焦炉逸散物(0.006μg/l)作用下,细胞的相对荧光素酶活性已显著增加,该剂量是等于或低于细胞存活率显著降低、MDA浓度显著增加、细胞Olive TM值和微核率显著增加所需的最低剂量。这些研究结果表明,HepG2/HSPA1A细胞的荧光素酶活性可以敏感地反映汽车尾气和焦炉逸散物对细胞的毒性效应。热休克反应是非特异性的细胞应激反应,RepG2/HSPA1A细胞的荧光素酶活性能够综合反映复合化学污染物对细胞的早期损伤。故HepG2/HSPA1A细胞体系可以用于评估环境复合污染物的综合毒性。综上所述,本课题的主要研究结果如下：(1)三种单一化学污染物(芘、苯并[a]芘和甲醛)和两种复合化学污染物(汽车尾气和焦炉逸散物)作用后,HepG2/HSPA1A细胞的相对荧光素酶活性均显著增加,非致癌的芘和较低浓度的汽车尾气(pg/l)也能显著增加细胞的荧光素酶活性；(2)在很低的剂量作用下(pg/l)我们即可观察到细胞的相对荧光素酶活性显著增加,这些剂量是等于或小于细胞存活率显著降低,细胞氧化损伤和遗传损伤水平显著增加所需的最低剂量,HepG2/HSPA1A细胞的荧光素酶活性可以作为环境污染物对细胞早期损伤的一个敏感指标；(3)所有的待测定的环境污染物作用后,HepG2/HSPA1A细胞的相对荧光素酶活性与细胞的氧化损伤和遗传损伤水平(MAD浓度、Olive TM值和微核率)之间呈显著正相关,HepG2/HSPA1A细胞的荧光素酶活性可以综合反映环境化学污染物所诱导的细胞氧化损伤和遗传损伤等毒性效应；(4)与检测细胞存活率、氧化损伤和遗传损伤水平的毒理学实验相比,用HepG2/HSPA1A细胞体系来检测环境污染物的毒性更加敏感；(5)热休克反应是非特异性的细胞应激反应,与评价细胞的某些特定毒性终点效应的毒理学实验相比,HepG2/HSPA1A细胞体系可以用于评估单一和复合化学污染物的综合毒性。本课题的创新之处在于：(1)选用了具有Ⅰ相和Ⅱ相反应所需的各种代谢酶活性的HepG2细胞来构建毒性评估体系；(2)选用空气中很常见的三种单一化学污染物(芘、苯并[a]芘和甲醛)和两种复合污染物(汽车尾气和焦炉逸散物)来证实HepG2/HSPA1A细胞体系在环境污染物毒性评估中的应用；(3)将HepG2/HSPA1A细胞体系与其他的测定细胞存活率、氧化损伤和遗传损伤水平的毒理学实验进行比较,并对结果进行相关性分析以证实HepG2/HSPA1A细胞体系在环境污染物对细胞的综合毒性评估中的应用和该细胞体系的敏感性。本研究有待进一步研究之处有：(1)有待进一步研究HepG2/HSPAlA细胞体系在空气中其他的单一和复合化学污染物的毒性评估中的应用；(2)有待进一步将HSPA1A启动子荧光素酶报告基因技术与其他的细胞毒理学实验进行比较以充分证实HepG2/HSPA1A细胞体系是否可以用于评估环境污染物的综合毒性；(3)有待进一步构建活体毒性评估体系(如转基因鼠)来更真实的反映环境污染物的毒性。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R114

【参考文献】