【摘要】：B淋巴细胞活化因子(B cell activating factor belonged to TNF family, BAFF)，又称B淋巴细胞刺激因子，不仅能够调节B淋巴细胞功能，还能通过表达在活化T淋巴细胞上的跨膜激活剂及钙调亲环素配体相互作用分子(transmembraneactivator or calcium-modulating cyclophylin ligand-interactor, TACI)和BAFF受体(BAFF receptor, BAFFR)调节T淋巴细胞免疫应答。研究发现，BAFF及其同系物增殖诱导配体(A proliferation-inducing ligand, APRIL)水平的异常与类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)、系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)等自身免疫病的发病密切相关。重组人TACI-Ig融合蛋白（recombination humanTACI-Ig, rhTACI-Ig）包括TACI的胞外段和人免疫球蛋白(immunoglobulin, Ig)G1的Fc段，可以作为一种诱骗受体竞争性结合BAFF和APRIL。本研究在用BAFF或抗CD3单抗体外活化C57BL/6小鼠脾脏T淋巴细胞的基础上，观察rhTACI-Ig对T淋巴细胞功能的影响及分子机制；同时利用血蓝蛋白（keyhole limpethaemocyanin, KLH）建立C57BL/6小鼠抗原特异性T淋巴细胞反应模型，进一步探讨rhTACI-Ig的作用机制，为筛选治疗以T淋巴细胞功能异常为主的自身免疫病药物和寻找新的药物作用靶点提供理论依据。 目的：观察rhTACI-Ig体外对BAFF、抗CD3抗体或血蓝蛋白作用的T淋巴细胞增殖、活化和分化功能的影响，并探讨rhTACI-Ig作用的分子机制。 方法：采用BAFF (0.1μg/ml)或抗CD3抗体(10μg/ml)分别刺激脾脏T淋巴细胞，同时给予rhTACI-Ig (0.01,0.1,1,10,100μg/ml)、阳性对照药rhTNFR:Fc (10μg/ml)或阴性对照药IgG-Fc (10μg/ml)。3H-TdR参入法观察各给药组对脾脏T淋巴细胞增殖功能的影响；ELISA法检测培养上清中IL-2、IL-4、干扰素-γ（interferon-gamma, IFN-γ）、转化生长因子β （transforming growth factor-β,TGF-β）水平；流式细胞仪检测T淋巴细胞各亚群比率的变化情况；Western-blot法检测BAFF介导的NF-κB信号通路各相关蛋白表达情况。采用血蓝蛋白免疫小鼠，取脾脏组织切片做病理分析，ELISA法检测小鼠血清中KLH-IgM、KLH-IgG、BAFF、APRIL抗体水平及IL-2/IL-4比率；同时分离正常组和模型组小鼠的脾脏T淋巴细胞，体外分别用BAFF刺激，并给予rhTACI-Ig(0.01,0.1,1,10,100μg/ml)，3H-TdR参入法观察各给药组对T淋巴细胞增殖的影响，ELISA法检测T淋巴细胞培养上清中IL-2、IL-4、IFN-γ、TGF-β水平，流式细胞仪检测T淋巴细胞各亚群百分率的变化情况。 结果: 1. RhTACI-Ig体外对BAFF或抗CD3抗体诱导的C57BL/6小鼠脾脏T淋巴细胞功能的影响 1.1RhTACI-Ig体外对T淋巴细胞增殖功能的影响BAFF和抗CD3抗体体外均能刺激T淋巴细胞增殖，rhTACI-Ig (0.1,1,10,100μg/ml)体外可明显抑制BAFF刺激的T淋巴细胞增殖反应; rhTACI-Ig (0.1,1,10,100μg/ml)和rhTNFR:Fc (10μg/ml)可明显抑制抗CD3抗体刺激的T淋巴细胞增殖反应。 1.2RhTACI-Ig体外对T淋巴细胞培养上清细胞因子水平的影响 BAFF刺激可以使胸腺淋巴细胞产生IL-2、IL-4、IFN-γ和TGF-β水平明显升高，rhTACI-Ig (10,100μg/ml)可以明显降低IL-2水平；rhTACI-Ig (1,10,100μg/ml)可以明显降低IL-4和TGF-β水平；rhTACI-Ig (0.1,1,10,100μg/ml)可以明显降低IFN-γ水平；抗CD3抗体可使T淋巴细胞产生IL-2、IL-4、IFN-γ和TGF-β水平明显升高，rhTACI-Ig (1,10,100μg/ml)可不同程度降低上述细胞因子水平。RhTNFR:Fc可以明显降低BAFF刺激的IL-4和IFN-γ水平，降低抗CD3抗体刺激的IL-2、IL-4水平。 1.3RhTACI-Ig体外对T淋巴细胞存活情况及其表面CD25和CD69分子动态监测的影响 BAFF刺激后CD69和CD25分子表达水平随时间不断增长，到72h为最高点，RhTACI-Ig体外能抑制CD25和CD69表达水平的升高；BAFF刺激能延长T淋巴细胞存活时间，rhTACI-Ig能抑制T淋巴细胞存活情况。 1.4RhTACI-Ig体外对T淋巴细胞各亚群比率的影响 BAFF体外刺激T淋巴细胞，可使活化Th细胞(CD4+/CD25+)和表达活化诱导分子Th细胞(CD4+/CD69+)比率显著升高，未致敏Th细胞(CD4+CD62L+)比率显著降低，对表达CD40L的Th细胞(CD4+/CD154+)比率没有影响，rhTACI-Ig(0.1,1,10,100μg/ml)可明显降低活化Th细胞和表达活化诱导分子Th细胞比率，rhTACI-Ig（10,100μg/ml）可明显提高未致敏Th细胞的比率；抗CD3抗体体外刺激T淋巴细胞，可使表达活化诱导分子Th细胞和表达CD40L的Th细胞比率显著升高，活化Th细胞和未致敏Th细胞比率显著降低；rhTACI-Ig (10,100μg/ml)可显著抑制表达活化诱导分子Th细胞比率，rhTACI-Ig (0.1,1,10,100μg/ml)可不同程度抑制表达CD40L的Th细胞比率，rhTACI-Ig (100μg/ml)可升高活化Th细胞比率，rhTACI-Ig(10μg/ml)可显著提高未致敏Th细胞比率。 1.5RhTACI-Ig体外对BAFF介导的NF-κB信号通路各分子表达的影响 BAFF能降低T淋巴细胞TACI受体表达，升高BAFFR受体表达，使IKKα和NF-κB p50表达水平升高，IκBα表达降低，但对IKKγ表达没有明显影响；rhTACI-Ig(1,10μg/ml),(0.1,1,10μg/ml)和(0.1,1,10μg/ml)能分别降低BAFF刺激的BAFFR、IKKα和NF-κB p50表达水平，rhTACI-Ig (10μg/ml)和(1,10μg/ml)能分别升高BAFF刺激的TACI和IκBα表达水平。 2. RhTACI-Ig体外对血蓝蛋白免疫C57BL/6小鼠脾脏T淋巴细胞的作用 2.1KLH免疫小鼠血清中KLH-IgM、KLH-IgG、BAFF、APRIL、IL-2、IL-4水平及脾脏病理改变 KLH免疫小鼠脾脏动脉周围淋巴鞘细胞密度增高，淋巴滤泡异常增生，边缘区细胞密度增大，红髓充血评分以及生发中心数量增多；KLH免疫小鼠血清中KLH-IgM、KLH-IgG抗体水平均明显升高， BAFF、APRIL水平升高，IL-2水平降低，IL-4水平显著升高，导致IL-2/IL-4比率降低。 2.2RhTACI-Ig体外对T淋巴细胞增殖情况的影响 血蓝蛋白免疫小鼠T淋巴细胞增殖功能亢进，BAFF能进一步刺激T淋巴细胞增殖，rhTACI-Ig (1,10,100μg/ml)给药组可以不同程度抑制T淋巴细胞的增殖反应。 2.3RhTACI-Ig体外对T淋巴细胞培养上清中各细胞因子水平的影响 KLH免疫小鼠T淋巴细胞分泌IL-4和IL-5增多，IL-2分泌减少，IFN-γ分泌略有下降；BAFF刺激能进一步增加IL-4、IL-5水平，提高IL-2水平和IFN-γ水平并远超正常值。RhTACI-Ig (100μg/ml)给药组可显著降低IL-4和IL-5水平，rhTACI-Ig (10,100μg/ml)给药组可不同程度降低BAFF刺激的IL-2和IFN-γ的分泌水平。 2.4RhTACI-Ig体外对T淋巴细胞各亚群比率的影响 KLH模型组小鼠CD3+CD4+T、 CD3+CD69+、CD4+CD154+T淋巴细胞比率显著升高，BAFF体外刺激能使其进一步升高，rhTACI-Ig(1,10,100μg/ml)可以明显抑制BAFF刺激的CD3+CD4+T淋巴细胞比率，rhTACI-Ig (10,100μg/ml)可以不同程度抑制BAFF刺激的CD3+CD69+和CD3+CD154+T淋巴细胞比率；KLH模型组小鼠CD4+CD62L+T淋巴细胞比率显著降低，BAFF刺激能使其进一步降低，rhTACI-Ig (0.1,1,10,100μg/ml)给药组可以不同程度提高BAFF刺激的CD3+CD62L+T淋巴细胞比率。 结论： 1. RhTACI-Ig体外能抑制BAFF或抗CD3抗体刺激的T淋巴细胞增殖，降低升高的细胞因子(IL-2、IL-4、IFN-γ、TGF-β)水平，调节各T淋巴细胞亚群比率，并能通过调节BAFFR和TACI受体的表达介导NF-κB信号通路，达到治疗效果。 2.血蓝蛋白免疫小鼠血清中BAFF、APRIL、KLH-IgM、KLH-IgG抗体水平以及IL-4水平均增高，IL-2水平降低；脾脏动脉周围淋巴鞘细胞密度增高，淋巴滤泡异常增生，，边缘区细胞密度增大，红髓充血评分以及生发中心数量增多。RhTACI-Ig体外能抑制BAFF刺激的KLH模型小鼠T淋巴细胞增殖情况，调节各细胞因子水平和T淋巴细胞亚群比率，其抑制作用可能是通过中和内源性和外源性BAFF和APRIL而发挥的。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R392
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2495102
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