神经肽CGRP、SP、NPY对骨髓基质干细胞的生物学效应及其机制研究

发布时间：2019-06-16 15:38

【摘要】：研究背景由于创伤、感染等各种原因造成的骨折、骨不愈合等一直是威胁人类生命健康的医学难题。对于从根本上提高其治疗效果而言,明确骨形成、重建、塑形的病理生理学特点及其生物学机制是其基础和出发点。骨组织是一种伴随着细胞外基质矿化、根据需要不断自我修复的复杂动态组织,亦是带有血管、神经支配的生物活性组织,因此,骨折修复过程中既有机体多种组织、细胞因子之间错综复杂的协同作用,更与血液供应、神经支配密切相关,其修复区域内环境的生物学稳定性尤其是血液供应和神经支配的重建是关键因素。血液供应的重建对于骨及移植物保持生物学活性的重要性已被众多实验及临床实践所证实,除此之外,骨组织再生中神经因素可能同样发挥着重要作用。在早期进行的骨发育学研究显示：一些先天颅面发育缺陷疾病常常伴有神经系统发育障碍的现象提示神经系统对骨发育支配和调节的重要性。再者,众多解剖学、神经生物学以及临床实践研究均已证实神经因素对骨折愈合、骨修复具有确切的生物调节作用。但是目前对神经因素调控骨组织再生的生物学机制研究较少。本课题组的前期研究发现植入感觉神经能够促进组织工程骨成骨及修复骨缺损,且骨再生区域的神经肽CGRP、SP、NPY含量明显增加,提示我们神经肽类物质在骨折愈合、重建中可能起到重要作用,可能是神经发挥其调控作用的关键因素。近年来,神经肽类物质在骨折愈合、骨组织再生中的重要作用已逐渐得到人们的重视,并成为国内、外学者新的研究热点之一。神经肽是神经系统产生的具有神经调节活性的肽类物质,具有广泛的生物学效应,其中,降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide, CGRP)、P物质(substance P, SP)、神经肽Y(neuropeptide Y)是最具代表性的物质。CGRP和SP是感觉神经纤维分泌的两种主要神经肽；NPY是中枢神经系统中含量最高、分布最广的神经肽之一,介导中枢神经系统与外周神经系统调控的重要因子。目前的研究多局限在神经肽对成骨细胞的影响,对成骨细胞的前体细胞——骨髓基质干细胞(Bone marrow stem cells, BMSCs)的研究较少。BMSCs具有强大的增殖能力和多向分化潜能,在骨代谢中扮演着重要角色,在适宜的体内或体外环境下可被诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、基质细胞和造血细胞等多种细胞,是骨组织工程研究领域的理想种子细胞。因此,阐明神经肽对BMSCs的具体作用有助于我们更好的了解神经肽在骨代谢过程中发挥的作用,进一步揭示骨再生过程中的神经生物学作用机制。本实验通过BMSCs的体外培养,从细胞学角度,采用免疫组织化、细胞迁移、PCR和Western Blot等方法,对神经肽及其受体在BMSCs中的表达与生物学效应进行研究,为进一步深入研究骨再生、骨代谢过程中的神经生物学调节分子转导机制奠定坚实基础,同时也可为其在骨折以及骨代谢疾病中的临床应用提供新的思路和实验依据。研究目的 1.明确神经肽CGRP、SP、NPY受体在BMSCs及其成骨分化中的表达趋势。 2.明确神经肽CGRP、SP、NPY调控BMSCs增殖的作用及其机制。 3.初步探明神经肽CGRP、SP、NPY在BMSCs成骨分化中的生物学效应及机制。 4.初步探明神经肽CGRP、SP、NPY对BMSCs迁移的作用。研究方法 1. BMSCs及其成骨分化过程中神经肽CGRP、SP、NPY受体的表达检测采用全骨髓培养法分离培养SD大鼠骨髓基质干细胞,分别使用流式细胞仪检测和免疫细胞化学对BMSCs表型标志物和成骨分化进行鉴定,取第2代BMSCs用于实验。分为诱导成骨组及未诱导组,在BMSCs传代(第2代)培养的不同时期(1、2、3w),采用Real TimeRT-PCR、Western Blot检测细胞CGRP、SP、NPY受体mRNA及蛋白表达。 2.神经肽CGRP、SP、NPY对BMSCs增殖的调控作用及其机制研究将活力大于95%的大鼠第2代BMSCs细胞以104/孔密度种于96孔细胞培养板,细胞贴壁后换无血清培养基24小时,使细胞同步化于G0期。后以CGRP (10-8mol/L), SP (10-8mol/L), NPY (50nM)分别刺激1,3,5,7d,采用MTT法测定OD值,绘制细胞生长曲线；采用RT-PCR、Western Blot检测细胞周期调控蛋白的表达。 3.神经肽CGRP、SP、NPY对BMSCs成骨分化的作用及相关生物学机制研究将CGRP (10-8mol/L), SP (10-8mol/L), NPY (50nM)分别作用于传代(第3代)培养的BMSCs,常规培养组作为对照,于不同时间点(1、7、14、21d),应用Western Blot比较分析BMSCs中成骨细胞特征性物质(ALP、BGP)合成情况；应用免疫细胞化学、Western Blot对细胞中骨形态发生蛋白(BMP-2)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)的表达进行检测分析。 4.神经肽CGRP、SP、NPY对BMSCs迁移的作用及其机制研究应用Real TimeRT-PCR、Western Blot检测血管细胞细胞粘附分子(VCAM-1)表达,对神经肽CGRP、SP、NPY影响BMSCs粘附及迁移作用机制进行初步分析；利用细胞划痕实验、趋化实验对神经肽作用BMSCs后的迁移能力进行检测。 5.统计学方法计量资料以x±s表示,选取检验水准α=0.05,采用SPSS 13.0统计软件进行统计分析。 Transwell细胞趋化实验数据采用多样本均数比较的方差分析(One-Way ANOVA)进行统计学分析,经Levene检验满足方差齐性后,组间比较以LSD方法为准,方差不齐的数据以近似方法DunnetT3分析结果为准。 BMP2、VEGF表达的Western Blot检测中同一时间点多个组间的数据采用One-Way ANOVA进行统计学分析,经Levene检验满足方差齐性后,组间比较以LSD方法为准,方差不齐的数据以近似方法DunnetT3分析结果为准；同组两个时间点之间的数据比较采用独立样本t检验,并检验其方差齐性。其他实验数据均采用重复测量数据的方差分析；当资料满足球形假设时以Sphericity Assumed方法为准。当资料不满足球形假设时需用ε校正系数来校正自由度。对有显著意义的主效应进行多重比较,采用LSD法。对同一时间点多组别的比较采用One-Way ANOVA进行分析,同一组不同时间点的数据比较采用重复测量的方差分析,经Levene检验数据满足方差齐性以LSD方法为准,方差不齐的数据以近似方法DunnetT3分析结果为准。结果 1. BMSCs及其成骨分化过程中神经肽CGRP、SP、NPY受体的表达检测 1.1 BMSCs的分离和鉴定全骨髓培养的第2代BMSCs表面标志物鉴定结果分别为：CD29 (96%). CD44 (95.9%), CD45 (2.9%)、CD34 (2.6%);免疫细胞化学结果显示：成骨细胞诱导7d后,ALP染色阳性,COLⅠ染色阳性；成骨诱导14d后,BGP染色阳性,COLⅢ染色阴性。Western Blot检测结果显示：各时间点的成骨诱导组与未诱导组相比ALP、BGP, COLⅠ蛋白含量随诱导时间依次增高,COLⅢ随诱导时间下降,因此本实验获取的BMSCs具有干细胞特性,采用适当方法可诱导其向成骨细胞分化。 1.2 BMSCs成骨分化过程中神经肽CGRP、SP、NPY受体的表达 CGRP受体的表达：Real Time RT-PCR结果显示同一时间点诱导组CGRP受体mRNA表达量高于未诱导组,诱导组CGRP受体mRNA表达以时间依赖性的方式不断增高；Western Blot结果显示同一时间点诱导组CGRP受体的蛋白水平高于未诱导组,诱导组CGRP受体蛋白水平以时间依赖性的方式增高。 SP受体的表达：BMSCs及其诱导的成骨细胞有SP受体表达；SP受体mRNA在诱导1周时下降,在诱导至3周时显著增高；同一时间点诱导组SP受体的蛋白水平高于未诱导组,诱导组SP受体蛋白水平在第3周时显著增高,呈明显的时间依赖性。 NPY受体的表达：Real Time RT-PCR结果显示同一时间点诱导组Y1受体mRNA表达量低于未诱导组,诱导组和未诱导组Y1受体mRNA表达均以时间依赖性的方式增高。Western blot结果显示同一时间点诱导组Y1受体的蛋白水平高于未诱导组,诱导组和未诱导组Y1受体蛋白水平以时间依赖性的方式减少。 2.神经肽CGRP、SP、NPY对BMSCs增殖的调控作用及其机制研究 2.1神经肽CGRP、SP、NPY对BMSCs增殖作用大鼠BMSCs在三种神经肽干预的不同时间点之间OD值均有显著性差异(F=143.271, P＜0.001). CGRP、NPY组在第1天OD值最小,之后随培养时间显著升高,至第9天达到最大值；SP、对照组在第1天OD值最小,之后随培养时间显著升高,至第7天达到最大值,在第9天时下降；干预组与干预时间存在交互效应(F=5.215,P0.001)。各时间点的神经肽组与对照组相比OD值增高显著,均有显著差异(P0.05)。其中,SP组的促大鼠BMSCs增殖效率最高。 2.2细胞增殖相关调控基因表达检测采用Western Blot技术,检测CGRP、SP、NPY对BMSCs细胞周期素cyclinD1、cyclinE, p53基因蛋白表达的影响。CGRP组中cyclinDl蛋白表达在第5d时达到高峰,与对照组比较增高明显,有统计学意义(P0.05)；3、5、7d的SP、NPY组与对照组相比,cyclinD1蛋白表达减少,有统计学意义(P 0.05); CGRP、SP、NPY组促进cyclinE蛋白表达的作用均在第5d时达到高峰,有统计学意义(P0.05)；3、5、7d的CGRP、SP、NPY组p53蛋白表达与对照组相比减少明显,有统计学意义(P0.05)。 3.神经肽CGRP、SP、NPY对BMSCs成骨分化的作用及相关生物学机制研究 3.1成骨细胞特征性物质合成检测 Western Blot检测结果：使用成骨诱导培养基的条件下,采用不同浓度的CGRP、SP、NPY作用于BMSCs,在7、14、21d均明显促进ALP和BGP的蛋白表达量,同一时间的神经肽作用组与对照组相比差异均有统计学意义(P0.05)。 3.2 BMP2、VEGF表达检测免疫细胞化学染色结果显示：在神经肽CGRP、SP、NPY作用后的5、7d,BMP2、VEGF染色阳性,胞质呈棕色。Western Blot结果显示：第5天、第7天的三种神经肽组与对照组相比,BMP2蛋白表达增加明显,四组间差异有统计学意义(第5天：F=292.722,P0.001；第7天：F=1670.207,P0.001)。其中,第七天时,CGRP组、SP组、对照组中BMP2的蛋白表达高于第5天；第7天时,NPY组中BMP2蛋白表达低于第5天,均有显著性差异(P0.05)。第5天的三种神经肽与对照组相比,VEGF蛋白表达增加明显,四组间差异有统计学意义(F=429.338,P0.001)。第7天时,三种神经肽组中VEGF蛋白表达高于第5天,均有显著性差异(P0.05)。 4.神经肽CGRP、SP、NPY对BMSCs迁移的作用及其机制研究 4.1细胞划痕实验观察结果：与对照组相比,三种神经肽均能不同程度的促进BMSCs迁移,其中,以SP组7、9d的作用最强,细胞迁移的总距离和速度明显增加。 4.2 Transwell细胞趋化实验结果：对照组、CGRP组、SP组、NPY组刺激组细胞迁移数分别为(1.11±0.49)、(3.20±1.77)、(4.78±1.77)、(4.86±0.96)个／高倍镜视野,各神经肽作用组与对照组比较细胞迁移数目增加,四组间差异有统计学意义(F=20.021,P0.001)。 4.3 VCAM-1的RT-PCR检测大鼠BMSCs在CGRP干预的不同时间点VCAM-1mRNA表达均有显著性差异(F=484.012, P0.001)。CGRP组中VCAM-1mRNA表达具有时间依赖性,不断递增,在第7天时达到高峰：干预组与干预时间存在交互效应(F=683.607,P0.001)。其中,第3天、第5天、第7天的CGRP组与对照组相比VCAM-1mRNA表达明显增加,均有显著性差异(P0.05)。其他两种神经肽均未能检测到VCAM-1表达。结论 1. BMSCs表达CGRP、SP、NPY受体,在成骨分化过程中各种受体的表达趋势各异,可能与其在骨重建过程中的不同介导作用有关。 2. CGRP、SP、NPY对BMSCs的增殖有直接促进作用,通过影响cyclinD1、cyclinE、P53等细胞周期相关蛋白的表达是其可能的作用机制。 3. CGRP、SP、NPY促进BMSCs向成骨细胞分化,影响成骨特征性蛋白的表达是其可能的作用机制之一。 4. CGRP、SP、NPY在调控BMSCs成骨分化的同时显著提高BMP2、VEGF的蛋白表达。 5. CGRP、SP、NPY作用后能诱导BMSCs的迁移,对其具有趋化作用。 6. CGRP、SP、NPY可能通过对BMSCs增殖、分化及迁移的调控影响骨再生及重建。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R329

【参考文献】