温度敏感型干细胞移植联合亚低温治疗脑创伤的实验研究

发布时间：2019-08-05 20:03

【摘要】：目的：建立一种温度敏感型干细胞系,研究其在亚低温(33℃)和正常体温(37℃)两种环境下的增殖与分化特点,同时利用BDNF的营养和诱导作用增加移植干细胞向神经元方向的分化比例,为脑外伤患者接受亚低温治疗期间实施干细胞原位移植打下基础。方法：采用原代细胞贴壁培养法培养人源性UCMSCs,流式细胞术进行表面标记蛋白鉴定,体外诱导其向神经细胞分化。用含温度敏感性猿猴病毒40大T抗原(tsSV40LT)的表达质粒转染UCMSCs, PCR检测外源基因的整合,绘制其在33℃和37℃培养条件下的细胞生长曲线；流式细胞术检测细胞周期,PCR-ELISA端粒酶检测法检测端粒酶活性,Western Blot法检测细胞周期调控蛋白---cyclin D1、CDK2和P16蛋白的表达；血清依赖实验及软琼脂克隆形成实验检测该细胞系在两种温度下的致瘤潜能；利用腺病毒载体转染BDNF进入UCMSCs, ELISA方法测定BDNF分泌时相,免疫荧光方法检测转染与非转染细胞表达NSE和GFAP的比例；建立去胸腺小鼠颅脑液压打击模型进行干细胞原位移植,脑组织标本行增殖细胞核抗原(PCNA)免疫组化及原位细胞凋亡检测,实验动物予以神经功能缺陷评分。结果：利用原代贴壁细胞培养法成功获得UCMSCs,流式细胞结果符合UCMSCs特征,经体外条件诱导,UCMSCs可表达神经元和神经胶质细胞标记蛋白；PCR结果显示tsSV40LT抗原的基因片段被成功整合入干细胞,端粒酶活性高,cyclin D1和CDK2高表达,P16低表达,并高表达nestin,不表达NSE和GFAP,同时该细胞系在33℃时增殖旺盛,可耐受极低的营养条件,并可在软琼脂中形成小的细胞克隆；在37℃条件下细胞增殖缓慢甚至停滞,端粒酶活性低,cyclin D1和CDK2的表达强度明显低于33℃条件,P16则相反,与此同时nestin表达强度明显下降,NSE和GFAP表达水平上升,低营养耐受力下降,无细胞克隆形成；BDNF的表达水平于病毒转染后第72h达到高峰,此期干细胞NSE阳性细胞比例明显增多(P0.05),相反GFAP阳性细胞比例下降；动物体内结果显示,亚低温治疗期间的脑组织高表达PCNA,凋亡细胞少见；常温组脑组织则低表达PCNA,创伤灶周边见较多凋亡细胞存在。结论： (1)借助tsSV40LT抗原建立的温度敏感型UCMSCs细胞系,在细胞增殖和1分化方面具有显著的温度可调控性特征,即在其适宜温度下(33℃)增殖能力旺盛,并维持在前体细胞水平,极少产生细胞分化；当其处于37℃环境中时则停止增长,转而分化为神经细胞； (2)温度敏感型UCMSCs细胞系在其适宜温度下存在一定的致瘤性(对低营养环境的高耐受力和半固体介质中的强克隆形成能力),但当其处于非适宜温度(37℃)下则几乎完全失去了增殖能力,也不再具有致瘤性。其潜在致瘤性可以通过改变温度得到有效控制； (3)常温条件下在脑创伤及其近缘部位移植的干细胞,绝大部分因为不耐受创伤灶半损伤带的低营养、高毒素环境而死亡；但在亚低温环境中,在创伤灶半损伤带移植温度敏感型的UCMSCs,可见存活的细胞显著增多,同时凋亡减少,动物神经功能得到有效恢复； (4)通过对干细胞进行BDNF基因转染可增加干细胞向神经元而非神经胶质细胞的分化比例,结合其自身的神经营养作用,进一步提高干细胞恢复创伤后神经运动功能的潜能。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R329

【参考文献】