蛋氨酸负载对大鼠肝细胞同型半胱氨酸代谢的影响

发布时间：2019-09-12 09:43

【摘要】：目的体外培养正常BRL大鼠肝细胞，进行蛋氨酸负载（methionine loading）后，测定Hcy相关代谢物及代谢酶的变化，探讨蛋氨酸负载对大鼠肝细胞Hcy相关代谢途径的影响并探讨其相关机制，以建立高同型半胱氨酸细胞模型，为进一步研究高同型半胱氨酸血症的营养干预及其机制奠定基础。方法 1.采用含10%胎牛血清的培养液传代培养BRL大鼠肝细胞。 2.采用MTT法检测不同浓度Met负载对肝细胞存活率的影响。 3.采用HPLC法检测肝细胞内和培养液中Hcy及相关代谢物的含量。 4.采用氨基酸自动分析仪检测培养液中与Hcy代谢相关的氨基酸含量及细胞内BHMT活性。 5.采用HPLC法测定细胞内SAM、SAH含量及SAHH活性。 6.采用分光光度法测定细胞内CBS和MS活性。结果 1.分别以10、20、50、100、200mmol/L Met作用于BRL大鼠肝细胞1、2、3、4h后，检测肝细胞存活率的变化。当Met浓度≤100mmol/L时，各时间点内肝细胞的存活率均在91.8%以上。 2.20、50、100mmol/L Met分别作用于肝细胞后，20、50mmol/L Met组Hcy的生成量在1~4h内基本持平，而100mmol/L Met组随时间延长Hcy的生成量有增加的趋势。因此，选择20、50mmol/L Met作用于肝细胞1h为Met负载模型的条件。 3.与空白对照组相比，20mmol/L Met组培养液中Hcy、Cys、Ser、胱氨酸的含量显著增加（P0.05），Glu、Gly、Tau的含量显著减少（P0.05）；50mmol/LMet组培养液中Hcy、Cys、胱氨酸的含量显著增加（P0.05），，Glu、Gly的含量显著减少（P0.05）。与20mmol/L Met组相比，50mmol/L Met组培养液中Hcy、Cys、GSH、Gly和Tau的含量显著增加（P0.05），Ser的含量显著减少（P0.05）。 4.与空白对照组相比，20和50mmol/L Met组SAM含量、SAM/SAH比值、SAHH的水解与合成活性均显著增加（P0.05）；BHMT活性显著降低（P0.05）；20mmol/L Met组的MS活性显著降低（P0.05）；50mmol/L Met组的SAH含量显著减少（P0.05）。与20mmol/L Met组相比，50mmol/L Met组SAM和SAH的含量显著减少（P0.05），SAM/SAH比值显著增加（P0.05）。结论 1.成功建立了Met负载大鼠肝细胞模型。 2.对培养液中Hcy及其代谢相关的一些氨基酸的含量进行分析。结果表明，Met负载显著增加Hcy、Cys含量，影响Glu、Gly、Ser的含量，提示高Met负载后Hcy及其代谢相关的一些氨基酸的含量均发生变化。 3.进一步对肝细胞匀浆中Hcy代谢相关物质SAM、SAH的含量和Hcy代谢相关酶SAHH、MS、BHMT、CBS活性进行分析。结果显示，Met可显著增加细胞内SAM含量，增加SAM/SAH比值，提示在Met作用下，细胞的转甲基化作用增强；在20mmol/L和50mmol/L Met组SAHH活性均显著性增强、BHMT活性均显著性降低，在20mmol/L Met组MS活性显著降低。酶活性测定结果提示在Met负载下，肝细胞的Hcy再甲基化途径受到抑制，且在20mmol/L Met组Hcy再甲基化途径被抑制程度更为显著。
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R329

【参考文献】