对Nr2f2及Nov在成骨细胞中作用的初步研究

发布时间：2019-09-16 17:06

【摘要】：RNA干扰(RNA interference, RNAi)是由与靶基因序列同源的双链RNA诱导的特异转录后基因沉默现象。其作用机制是双链RNA被Dicer降解,产生小片段干扰RNA(small-interfering RNA, siRNA),这些siRNA与序列同源的靶RNA互补结合,由特异性酶降解靶RNA,从而抑制靶基因表达。这种真核生物中普遍存在的抵抗病毒入侵、抑制转座子活动、调控基因表达的机制目前已发展出RNAi技术,并成功用于基因功能和信号转导系统上下游分子相互关系的研究。同时作为功能基因组研究领域中的有力工具,利用siRNA文库进行高通量筛选也越来越为人们所重视。 我的主要工作包含两部分的内容,一是验证Nr2f2是否具有促细胞增殖的作用。我们利用随机siRNA文库进行了基于功能表型的筛选,筛选出一个可促进小鼠MC3T3-E1前成骨细胞增殖的siRNA:siRNA-A281,小鼠全基因组表达谱芯片分析结果表明,MC3T3-E1细胞转染siRNA-A281后,细胞增殖速度加快,同时Nr2f2的表达增高,提示Nr2f2很可能介导了siRNA-A281的促MC3T3-E1细胞增殖的作用。 Nr2f2(核受体亚家族2,F组,第2号成员)也叫做COUP-TFⅡ(鸡卵清蛋白上游启动子-转录因子2),编码类固醇/甲状腺激素受体超家族的一个孤儿核受体。Nr2f2蛋白是一个配体诱导的转录因子,参与调节许多不同基因的表达,在控制包括心脏、血管、肌肉和四肢等一系列组织和器官发育的过程中发挥至关重要的作用。但目前对于Nr2f2在细胞增殖方面的功能却知之甚少,至今尚无Nr2f2影响前成骨细胞增殖的报道。 为明确Nr2f2在前成骨细胞增殖中的作用,本文在前期工作线索的基础上对Nr2f2在前成骨细胞增殖中的作用进行了初步的研究。构建了pcDNA-Nr2f2表达质粒,稳定转染后检测了细胞增殖速度及细胞周期分布。结果发现Nr2f2过表达能够促进小鼠前成骨细胞MC3T3-E1的增殖速度,主要通过使S期细胞比例增加而发挥作用。 我的第二部分工作是对Nov基因在促进细胞增殖方面的功能进行初步的探讨。肾母细胞瘤过度表达基因(nephroblastoma overexpressed gene, Nov)是CCN家族的成员之一,也叫做CCN3,其编码一种分泌的信号蛋白,目前研究表明其在细胞增殖与分化方面起到调控作用。MTS结果表明,过表达Nov基因后MC3T3-E1细胞增殖速度加快。同时我们发现人骨肉瘤细胞MG63中Nov mRNA有一个点突变。我们希望这些结果能够为对这两个基因作用机制的研究提供新的线索。 综上所述,我们利用基于细胞功能表型的高通量siRNA文库筛选方法发现Nr2f2在增殖加快的MC3T3-E1细胞中的表达增高,Nr2f2过表达能够促进小鼠前成骨细胞MC3T3-E1的增殖速度,主要通过使S期细胞比例增加而发挥作用。同时初步探讨了Nov基因促细胞增殖的功能。
【图文】：

用荧光实时定量PCR方法验证芯片分析的结果，同转染阴性对照 NCSIRNA的对照组相比，转染促增殖siRNA一A281的实验组细胞中的舫么心基因mRNA水平显著增高(图1)，增高为转染阴性对照 SIRNANC的细胞的4.57士0.30倍切 <0.01)。馨馨馨之望N卜。!uo协价.﨑立x.一拐劣，

本文编号：2536318