葡萄糖再灌注对人脐静脉内皮细胞氧化损伤及其机制研究

发布时间：2019-09-16 21:53

【摘要】：[背景] 目前,在全球范围内糖尿病的患病率迅速增长。尤其在中国,糖尿病已成为一个主要的公共健康问题。而随着糖尿病患病率的日益增高,临床上糖尿病相关的低血糖的发生率也随之增加。正如Cryer学者所说：“一次严重的医源性低血糖或由此诱发的心血管事件可能会抵消一生维持血糖在正常范围所带来的益处”。低血糖对中枢神经系统的损害,早已为人们熟知。目前,已有研究显示,持续低血糖可诱发急性心血管疾病,加剧糖尿病大血管病变,其机制可能与低血糖状态下的神经体液应激反应及持续低糖直接损伤血管内皮细胞有关。但近年来研究发现低糖后补充葡萄糖至一定水平也能诱发氧化应激,进而损伤细胞或组织。我们将这种低糖后再补充葡萄糖导致的细胞或组织损伤称为葡萄糖再灌注损伤(glucose reperfusion injury)。Haces ML等学者用胰岛素致大鼠低血糖后,给予25%的葡萄糖静脉输注,结果显示,葡萄糖再灌注21h,血糖已经恢复正常的情况下,仍可清晰地观察到大鼠大脑皮层的坏死细胞。葡萄糖再灌注9h和21h,大鼠脑的海马组织、皮层、纹状体中仍能检测出3-NT蛋白(3-nitrotyrosine过亚硝酸盐产物：3-硝基酪氨酸)表达增高。Suh等学者通过给小鼠注射胰岛素引起低血糖,葡萄糖再灌注30min时检测脑组织活性氧水平显示,葡萄糖再灌注诱导的氧化应激水平高于低糖本身。该学者还发现低糖后葡萄糖再灌注比单纯低糖对神经细胞的损伤更大,其可能机制是NADPH氧化酶活性增加所致。内皮细胞的损伤和功能改变与血管性疾病的发生密切联系。我科以往研究显示,低糖能够通过诱导氧化应激损伤内皮细胞。但目前葡萄糖再灌注是否能导致血管内皮细胞损伤,尚未见文献报道。血管内皮细胞的损伤和功能改变是糖尿病血管并发症和心血管事件发生、发展的重要环节。内皮细胞中一氧化氮(Nitric Oxide, NO)生成减少是内皮细胞功能障碍的重要标志。大量研究证实高糖导致的血管内皮损伤的机制包括胰岛素抵抗、脂代谢紊乱、氧化应激、炎症反应等,其中高糖引起的氧化应激起关键作用。氧化应激产生的大量氧自由基极易与NO反应,使之在瞬间灭活,从而影响血管内皮舒张功能。同时高血糖可使血管细胞的二酯酰甘油升高,抑制NO合成酶活性,导致NO合成减少,并能抑制由NO介导的环磷鸟苷生成而引起血管舒缩功能的改变。此外,高血糖可以诱导内皮细胞凋亡,从而造成血管壁的结构改变和血管内皮功能障碍。同样,在低糖对内皮细胞损伤的研究中发现,低糖可通过诱导氧化应激损伤血管内皮细胞,并造成内皮功能障碍。但目前尚未明确氧化应激是否参与葡萄糖再灌注对血管内皮细胞的损伤作用。氧化应激(Oxidative Stress,OS)是指由于氧自由基过量生成和/或细胞内抗氧化防御系统受损,导致氧自由基及其相关代谢产物过量聚集,从而对细胞产生多种毒性作用的病理状态。血管内皮细胞产生的氧化应激主要是由于内源性的氧化酶如：NADPH氧化酶(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase, NOX)、黄嘌呤氧化酶、线粒体电子传递链、脱耦联的一氧化氮合酶(uncoupled endothelial nitric oxide synthase eNOS)等与抗氧化酶如：超氧化物岐化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、过氧化氢酶(CAT)等之间的失平衡造成的。近年来大量证据表明,在血管内皮细胞中NADPH氧化酶和脱偶联的eNOS是氧化应激的重要来源。其中NOX是由多个亚基组成的复合酶,包括膜亚基细胞色素b558(p22Phox和gp91Phox蛋白)、多个细胞质亚基(p47Phox、p40Phox、p67Phox)和小G蛋白Rac。它通过将NADPH的两个电子连续传递给氧分子而介导氧化应激的发生,该过程可表示为(2O2+NADPH -2O2-+NADP++2H+)。eNOS是内皮型的一氧化氮合成酶,在正常情况下以二聚体的形式存在,后者能够催化NO的合成,而在各种病理情况下,二聚体解离成单体,单体不能完成反应过程中的电子链传递,从而则导致过氧化物的产生。后者进一步消耗细胞内的NO产生毒性更强的超氧亚硝酸盐(ONOO"), ONOO可继续使eNOS脱偶联损伤,从而形成恶性循环。目前已有研究证实,高糖和低糖诱导血管内皮细胞氧化应激损伤的机制与以上两条通路相关,但葡萄糖再灌注是否对内皮细胞也造成氧化损伤,其机制是否与NOX和脱偶联的eNOS途径相关?目前尚未见文献报道,有待于进一步研究。本课题采用人脐静脉内皮细胞株HUVEC-12为研究对象,观察低糖后不同浓度葡萄糖再灌注对内皮细胞的氧化损伤作用,并就氧化应激的可能机制进行探讨,为低血糖的防治提供新的实验资料。本研究包括以下两部分：第一章葡萄糖再灌注对人脐静脉内皮细胞的氧化损伤作用 [目的] 观察葡萄糖再灌注对人脐静脉内皮细胞HUVEC-12的功能影响及氧化应激情况。 [研究对象和方法] 1、以人脐静脉内皮细胞株HUVEC-12细胞为实验对象。采用含10%胎牛血清的RPMI1640完全培养基培养,置于37℃、5%C02的培养箱内。 2、实验培养基中葡萄糖浓度随机分为七组： (1)正常对照组(5.5mmM组,培养基GLU为5.5mM)； (2)持续无糖组(0mM组,培养基GLU为0mM)； (3葡萄糖再灌注组Ⅰ(0-5.5mM,即先在含GLU为0mM的培养基中培养2小时后更换为GLU 5.5mM的培养基培养) (4)葡萄糖再灌注组Ⅱ(0-11.1mM,即先在含GLU为0mM的培养基中培养2小时后更换为GLU11.1mM的培养基培养) (5)葡萄糖再灌注组Ⅲ(0-25mmM,即先在含GLU为0mM的培养基中培养2小时后更换为GLU25mM的培养基培养) (6)持续高糖组Ⅰ(11.1mM组,培养基GLU为11.1mM) (7)持续高糖组Ⅱ(25mM组,培养基GLU为25mM) 以上各组正式干预前均采用无血清培养基培养24小时,以保持各组细胞同步化生长。 2、分别在低糖2h后再灌注15min、30min、45min、1h、共4个不同的培养时间点,采用硝酸还原酶法测定NO2-、NO3水平。 3、低糖2h后再灌注15min化学比色法测定eNOS活性。 4、分别在低糖2h后再灌注15min、30min、45min、1h、共4个不同的培养时间点,利用超氧化物阴离子荧光探针荧光探(Dihydroethidium, DHE),微孔板检测系统(SpectraMax M5/M5e)在激发波535nm,发射波610nm测定细胞内荧光量的变化,间接反映ROS产量。 5、实验数据计量资料以均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS13.0软件进行统计分析,数据采用连续性重复测量的方差分析和单因素方差分析(One-way ANOVA);多重比较采用LSD法。同时考虑处理分组和重复测量的时间点两个因素。P0.05被认为差异具有统计学意义。 [结果] 1.各组细胞外不同时间点NO水平的测定：七组间的NO水平在各个时间点都存在显著性差异(组间效应：F=1936.989,P=0.000；组内效应：F=43.040,P=0.000)。具体分析如下： (1)浓度效应：①在同一时间点中,与5.5mM组比较,0mM组、11.1mM组、25mM组的NO水平都显著下降,P0.05。②再灌注组与持续无糖组、持续高糖组的NO水平比较：同一时间点中0-11.1mM组0mM组；0-25mmM组0mM组,P0.05。在15min和30min时0-11.1mM组11.1mM组；0-25mmM组25mM组,P0.05。③三组不同浓度再灌注组NO水平比较：同一时间点中0-25mmM组0-11.1mM组0-5.5mM组,P0.05。 (2)时间效应：随着时间的延长,0-5.5mM组NO水平逐渐恢复至正常水平,其余各组的NO水平呈逐渐下降趋势,在再灌注1h各组值基本下降至同一水平。 2.各组细胞eNOS活性的测定：七组细胞的eNOS活性存在显著性差异(F值=38.636,P=0.000)(1)与5.5mM组：(8.740±0.507)比较,0mM组(4.971±0.545)、11.1mM组(5.468±0.806)、25mM组(4.830±0.168)的eNOS活性都显著下降,P=0.000。(2)再灌注组与持续无糖组、持续高糖组的eNOS活性比较：0-25mM组0mM组,P=0.000。0-11.1mM组11.1mM组；0-25mM组25mM组,P=0.000。(3)不同浓度再灌注组eNOS活性比较：0-25mM组(2.040±0.437)0-11.1mM组(3.983±0.717)0-5.5mmM组(7.677±0.891),P=0.000。 3.各组细胞不同时间点ROS水平测定：七组间的ROS水平在各个时间点都存在显著性差异(组间效应：F=70.086,P=0.000；组内效应：F=7.309,P=0.009)。具体分析如下： (1)浓度效应：①在同一时间点中,与5.5mmM组比较, 0mM组、25mM组的ROS水平都显著升高,P0.05。②再灌注组与持续无糖组、持续高糖组的ROS水平比较：同一时间点中0-25mM组0mM组,P0.05；0-25mM组25mM组,P0.05。③三组不同浓度再灌注组ROS水平比较：同一时间点中0-25mM组0-5.5mM组;0-25mM组0-11.1mM组,P0.05。 (2)时间效应：随着时间的延长,0mM组、25mM组、0-25mM组的ROS水平呈现逐渐递增的趋势。但各时间之间差异无统计学意义。 4.相关性分析：HUVEC-12细胞中,ROS水平与NO水平存在显著性负相关,(r=0.-0.733,P=0.000,N=21),NO水平与eNOS活性存在显著性正相关(r=0.951, P=0.000,N=21), ROS水平与eNOS活性存在显著性负相关(r=-0.801,P=0.000,N=21) NO水平与再灌注浓度存在显著性负相关(r=-0.802,P=0.000,N=36) ROS水平与再灌注浓度存在显著性正相关(r=0.902,P=0.000,N=36)。 [结论] 1.低糖后葡萄糖再灌注能够导致HUVEC-12细胞功能障碍及氧化应激,这种损伤作用比单纯低糖和单纯高糖更严重。 2.葡萄糖再灌注浓度越高,HUVEC-12细胞氧化应激水平越高,功能障碍越严重。 3.葡萄糖再灌注引起的HUVEC-12细胞NO水平变化、eNOS活性与ROS含量呈负相关,提示葡萄糖再灌注导致的内皮细胞功能障碍可能与氧化应激相关。第二章葡萄糖再灌注诱导人脐静脉内皮细胞氧化应激的机制初探 [目的] 1、观察葡萄糖再灌注对人脐静脉内皮细胞抗氧化能力的影响。 2、了解NADPH氧化酶和脱偶联的eNOS在葡萄糖再灌注诱导的内皮细胞氧化应激中的作用。 [研究对象和方法] 1、以人脐静脉内皮细胞株HUVEC-12细胞为实验对象。 2、总抗氧化能力检测实验分组同第一部分。其余实验分组如下： (1)正常对照组(5.5 mM组,培养基GLU为5.5mM)； (2)葡萄糖再灌注组(0-25mM组,即先在含GLU为OmM的培养基中培养2小时后更换GLU为25mM的培养基培养)； (3)葡萄糖再灌注组联合Apocynin处理组(APO组：以500umol/l的apocynin预孵育1hr后再加入0mM的培养基培养2h,之后更换GLU为25mM的培养基培养)； (4)葡萄糖再灌注联合L-NAME处理组(L-NAME组：以100umol/l的L-NAME预孵育1hr后再加入0mM的培养基培养2h,之后更换GLU为25mM的培养基培养)。以上各组正式干预前均采用无血清培养基培养24小时,以保持各组细胞同步化生长,每组经过低糖2h后再灌注15min进行检测。 3、实验方法：用化学比色法测定细胞的总抗氧化能力,用荧光探针法测定细胞内ROS的产量。 4、实验数据计量资料以均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS13.0统计软件进行处理,各组均数比较采用单向方差分析(One-way ANOVA),组内多重比较采用LSD法。P0.05被认为差异具有统计学意义。 [结果] 1、总抗氧化能力(T-AOC)的测定：七组间的细胞总抗氧化能力存在显著性差异(F=20.217,P=0.000)。(1)与5.5mmM组(1.592±0.247),0mM组(0.571±0.090)、11.1mM组(0.860±0.272)、25mM组(0.625±0.127)的T-AOC都显著下降,P=0.001。 (2)再灌注组与持续无糖组、持续高糖组的T-AOC比较：0mM组0-25mM组;0mM组0-11.1mM组,P=0.042、P=0.025。25mM组0-25mmM组,P=0.022。 (3)不同浓度再灌注组T-AOC比较：0-5.5mM组(1.477±0.214)0-11.1mM组(0.960±0.195)0-25mM组(0.224±0.094),P=0.005、P=0.000。 2、加入抑制剂后ROS测定：5.5mM组,0-25mM组,APO组,L-NAME组的ROS水平分别为：0.663±0.124、1.398±0.132、0.789±0.054、0.917±0.058四组间存在显著性差异(F=31.99,P=0.000),与5.5mM组相比,0-25mM组ROS水平均显著升高,经过抑制剂APO和L-NAME处理后,APO组和L-NAME组的ROS水平分别下降(44%和34%),P=0.000。 3、加入抑制剂后总抗氧化能力(T-AOC)测定：5.5mM组,0-25mmM组,APO组,L-NAME组的T-AOC分别为：1.278±0.089、0.308±0.128、1.071±0.132、0.684±0.111。四组间存在显著性差异(F=24.027,P=0.000),与5.5mM组相比,0-25mM组T-AOC水平均显著下降,经过抑制剂APO和L-NAME处理后,APO组和L-NAME组的T-AOC水平分别上升(3.38倍和2.19倍),P=0.000和P=0.01。 [结论] 1.葡萄糖再灌注可导致HUVEC-12细胞总抗氧化能力下降。 2.葡萄糖再灌注诱导HUVEC-12细胞氧化应激的机制与NADPH氧化酶途径和脱偶联的eNOS途径相关。
【图文】：

细胞,再灌注,葡萄糖,脐静脉内皮细胞

第一章葡萄糖再灌注对人脐静脉内皮细胞的氧化损伤作用表l一3不同浓度葡萄糖再灌注对HUVEC一12细胞在不同再灌注时间的NO水平的影响Tab.l一3NOlevelsamongdifferentGRgrouPsatdifferenttimeofHtJVEC一12cells(n=3，x土s)作用时间组别15min30min45minlhO一5.SInM组73.842士0.78873.506士2.54076.284土2.84583.865士2.8040一1l.lmM组30.793士3.671*20.249士4.545*14.870士0.574*22.007士3.065*O一25mM组17.381士3.051*6.256士2.303*8.683士2.026*15.031士1.035*F值P值13.8420.00212.2570.00216.5830.001F值P值333.938349.5641301.782704.7600.0000.0000.0000.000*同一时间点内P<0.05VS.0一5.51刘功组;

标准曲线,标准曲线,再灌注,班组

Figl一2Proteineoneentratlonstandardeurve3.3化学比色法测eNOS活性结果经单因素方差分析，结果显示:不同葡萄糖浓度各组间eNOS活性差异有统计学意义(F一38.636，p=0.000)。(l)与5.51llM组比较，omM组、11.lmM组、25n1M组的eNOS活性都显著下降，P值均=0.000，见表1一4。(2)(2)再灌注组与持续无糖组、持续高糖组的eNOS活性比较:O一25mM组<omM组，P一0.000。0一11.11刊班组<11.InlM组;0一25InM组<25mM组，P=0.000，见表l一5。(3)不同浓度再灌注组eNos活性比较:o一25mM组<o一n.lmM组<O一5，smM组，P二0.000，见表1一6o
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R363

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