小鼠B淋巴细胞吞噬功能研究

发布时间：2019-09-20 15:24

【摘要】：吞噬是链接固有免疫和适应性免疫的重要免疫机制，其特征包括吞噬物直径大于0.5μm、肌动蛋白的聚合和重构、以及吞噬溶酶体（phagolysosomes）的形成等。吞噬在固有免疫中直接参与对病原的杀伤，而且吞噬机制中对抗原成分的分解是进一步的抗原处理和呈递的基础，因而也参与适应性免疫。经典免疫学观点认为，吞噬一般由巨噬细胞、单核细胞和中性粒细胞等专职吞噬细胞或上皮细胞、成纤维细胞等非专职吞噬细胞执行；而B淋巴细胞作为专职分泌抗体的适应性免疫细胞，不具有吞噬能力。近年来，在早期脊椎动物如硬骨鱼、两栖动物及爬行动物体内陆续发现了B细胞具有专职吞噬杀菌能力。而晚期脊椎动物如哺乳动物B细胞是否具有吞噬能力尚不明确。诸多线索提示B-1细胞很可能具有专职的吞噬能力。B-1细胞是一群不同于传统B-2细胞的B淋巴细胞亚群；在解剖上主要定位于腹膜腔、胸膜腔和脑脊髓膜腔等浆膜腔，表达既往认为只表达于专职吞噬细胞的CD11b分子，体外培养时可贴壁生长，外观上也更接近巨噬细胞，发育上与巨噬细胞等专职吞噬细胞关系密切，在演化上也对应于硬骨鱼等早期脊椎动物的B细胞；因而很有可能保留有吞噬功能。为进一步解释B细胞的演化路径及其在固有免疫及适应性免疫中的作用，本课题对小鼠B细胞的吞噬功能进行了深入研究。主要实验方法及结果： 1） B细胞吞噬现象形态学分析：利用C57/BL6小鼠为研究对象，腹腔注射FITC标记的60Co灭活金黄葡萄球菌、大肠杆菌及荧光微球，30分钟后灌洗腹腔（在体吞噬实验），取腹腔细胞磁珠分选B细胞行透射电镜观察；以及荧光标记CD19等以激光共聚焦显微镜观察以及流式分析。结果显示腹腔及脾脏B细胞吞噬了金葡菌、大肠杆菌及荧光微球。 2）肌动蛋白在B细胞吞噬中的作用分析：取野生型小鼠腹腔B细胞体外与FITC标记的60Co灭活金黄葡萄球菌共孵育（体外吞噬实验）8小时，以不同剂量秋水仙碱及细胞松弛素B等肌动蛋白抑制剂干预，流式检测吞噬率变化。结果显示肌动蛋白抑制剂可以剂量依赖性的抑制B细胞的吞噬率，提示B细胞吞噬过程需依赖肌动蛋白重构。 3）B细胞吞噬溶酶体形成观察：以荧光微球行在体吞噬实验后，取腹腔B细胞甩片，行酸性磷酸酶染色后以荧光显微镜观察。结果显示被内吞的荧光微球均与溶酶体相结合或被溶酶体完全包裹，提示吞噬性B细胞有正常的吞噬溶酶体形成机制。 4）B细胞杀菌能力分析：取腹腔B细胞体外与预先涂板计数过活金葡菌共孵育，庆大霉素保护法检测胞内菌在不同孵育时间后的存活量。发现B细胞内吞菌量相对有限，但杀菌效率与其他吞噬细胞接近。 5）吞噬性B细胞表型特征分析：以金葡菌行B细胞体外吞噬实验后荧光标记CD19、CD11b、CD5、B220（CD45Ro）等表型后行流式检测。结果显示吞噬性B细胞以CD11b~+B220~(low)的B-1细胞为主，其中CD5的B-1b细胞吞噬能力强于CD5~+的B-1a细胞。 6）B细胞吞噬受体分析：比较野生型鼠与TgV_H3B4鼠B细胞吞噬率；以不同浓度肌动蛋白（TgV_H3B4鼠BCR交叉识别抗原之一）干预抗原竞争阻断B细胞体外吞噬实验，以抗CD11b、TLRs、IgM等的各种抗体干预野生型小鼠B细胞体外吞噬，并分析吞噬率不同。结果显示阻断CD11b分子及TLR2等均不能阻断B细胞对金葡菌的吞噬，联合运用抗IgM重链及轻链抗体可有效阻断B细胞对金葡菌的吞噬；TgV_H3B4鼠腹腔B细胞吞噬率高于野生型鼠；且肌动蛋白可竞争抑制TgV_H3B4鼠腹腔B细胞对金葡菌的吞噬；这些均提示BCR充当了重要的吞噬受体。 7）吞噬性B细胞迁徙分析：在体吞噬实验不同时长后收获腹腔细胞流式分析B细胞吞噬率变化，结合CD11b染色分析表型分布，并取大网膜压片及脾脏冰冻切片荧光标记CD19后荧光显微镜观察。结果显示腹腔吞噬性B细胞数量在1小时之内迅速下降；1小时及1天之内大网膜和脾脏中可见携带金葡菌的B细胞出现，，随时间延长而增多；CD11b分子可促进迁徙；可见吞噬性B细胞可迅速经大网膜向脾脏等次级淋巴器官迁徙。 8）T细胞激活试验：B细胞体外吞噬灭活金葡菌后与CFSE标记的脾脏T细胞共孵育，5天后荧光标记CD4，流式细胞术检测增殖反应。结果显示吞噬性B细胞可引起抗原特异性的脾脏CD4+T细胞增殖反应，可见吞噬性B细胞可完成抗原呈递。主要结论：本研究首次揭示了哺乳动物B细胞的吞噬能力，其吞噬具有肌动蛋白依赖性，能够通过吞噬溶酶体机制等杀伤内吞的细菌，符合经典吞噬机制的特征；吞噬性B细胞具有CD11b介导的活跃的迁徙活动，并能够引起抗原特异性的CD4+T细胞增殖反应；BCR参与并促进了吞噬。本研究进一步提示B-1细胞在演化上与吞噬细胞关系密切。B细胞吞噬参与了抗原提呈反应，说明B细胞具有针对颗粒抗原适应性免疫应答的免疫始动能力。本研究有望为防治感染性疾病的疫苗开发提供新策略，并为过敏性疾病、免疫相关性疾病的免疫治疗提供新的思路。
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R392

【共引文献】