肠道病毒71型拮抗TLR3信号通路及其诱导细胞凋亡的机制研究

发布时间：2019-09-22 17:36

【摘要】：肠道病毒71型(EV71)是引起婴幼儿手足口病的主要病原体之一,其感染可导致中枢神经系统疾病,约90%的手足口重症病例均由EV71引起。目前EV71的致病机制尚不完全清楚,研究表明其感染后引起免疫系统的功能障碍与其致病机制相关。前期研究发现,干扰素可以抑制EV71在小鼠中的复制,EV71编码3C蛋白可以抑制干扰素的产生,但其具体机制尚不完全清楚。本文对EV713C蛋白对天然免疫的TLR3 (Toll-like receptor 3)信号通路的抑制作用和病毒对细胞凋亡的调控作用进行了研究,并进一步阐明了其作用的分子机制。结果显示,3C蛋白可以切割TLR3信号通路的效应分子p干扰素TIR结构域衔接蛋白(TIR-domain-containing adapter-inducing interferon-β, TRIF)并抑制其诱导的IFNβ和NF-κB启动子的激活。鉴于病毒感染后引起TRIF切割的机制一方面由病毒蛋白酶活性引起,另一重要原因是病毒感染引起半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)的激活,激活的Caspase引起TRIF切割。进而通过Caspase抑制剂Z-VAD抑制实验及TRIF中Caspase切割位点突变实验,发现3C蛋白诱导的TRIF切割并不依赖于Caspase。3C蛋白酶活性位点的突变实验,发现3C蛋白酶活性是TRIF切割所必需的。最后通过缺失突变和点突变的方法精确定位了3C蛋白在TRIF上的切割位点为Q312S313。所以EV71感染下调TLR3信号通路中的TRIF表达可能是其抑制Ⅰ型干扰素产生的原因之一。病毒感染后,机体除了通过产生干扰素来抑制病毒繁殖复制,还可以通过凋亡的方式来抑制病毒入侵,但是同时细胞凋亡也是病毒致病的主要机制之一。结果显示,EV71感染RD细胞可以明显的抑制细胞增殖,而这种抑制作用是由细胞凋亡引起的,因为通过检测凋亡相关的重要蛋白,发现EV71感染可以引起Caspase3、8的激活,并且Caspase3底物PARP也可以被切割,说明EV71感染RD细胞引起caspase依赖的细胞凋亡。在细胞凋亡过程中凋亡蛋白Bax起着重要的作用,EV71感染RD细胞后不仅可以检测到Bax蛋白表达的上调,还可以检测到Bax构象变化,进一步引起凋亡,说明Bax在EV71诱导的凋亡中起着重要作用。综上所述,EV713C蛋白可通过切割TRIF来拮抗TLR3信号通路中干扰素的产生,有关结果揭示了EV71抑制宿主天然免疫的另一机制。EV71感染RD细胞可以诱导Caspase和Bax依赖的细胞凋亡。这些结果为阐明EV71的致病机理提供了线索。
【图文】：

病毒颗粒

71型可以诱导Jurket细胞和神经细胞SK一N一SH凋亡I6.’01，在其致病性中起着用。但是有关EV71在横纹肌肉瘤细胞(RD)细胞中的凋亡机制研究还未本文通过凋亡重要特征蛋白的检测，发现EV71感染RD细胞可以引起Casp细胞凋亡，并且Bax在其诱导的凋亡中起着重要的作用，为进一步阐明其提供理论依据。EV71的基木特征颗粒结构道病毒71型属于小RNA病毒科，肠道病毒属，归属于肠道病毒A。EV71病三十面体立体对称的球形结构，无包膜和突出，直径约24一30nm，核酸为RNA，长约7o00bp。病毒编码的结构蛋白VPI，VPZ，VP3和vP4构成原聚体聚体再拼装成亚单位，60个亚单位通过各自的结构域相互连接，形成病毒l)。VPI，VPZ和VP3三个多肤暴露在病毒外壳的表面，而VP4包埋在病内侧与病毒核心紧密连接。

结构图,病毒基因,结构图,非编码区

EV71病毒的基因组为含有约7000核营酸的单股正链RNA，RNA中仅有一个开放阅读框(ORF)，编码含 2194个氨基酸的多聚蛋白，，在其两侧为5‘和3’非编码区(UTRs)，3‘末端有多聚腺营酸(polyA)尾(见图2)，而其sr末端共价结合有一个小分子量的蛋白(VPg)。该病毒的基因组从5’末端至3’末端依次排列着含有746个核营酸的5‘非编码区 (untranslationregion， UTR)、编码区IA(多肤Vp4)、IB(多肤vpZ)、IC(多肤Vp3)、ID(多肤Vpl)、ZA(特异性蛋白酶)、ZB、ZC、3A、vPg(5‘末端结合蛋白)、3C(特异性蛋白酶)、3D(RNA多聚酶组分)、3‘末端非编码区(83个核普酸)以及多聚腺普酸尾(AAAn)。病毒RNA正链和负链的5‘末端和3‘末端非编码区中分别含有多肤翻译的起始信号以及RNA合成的起始信号，VPg蛋白通过其酪氨酸残基的轻基基团与RNAS‘末端的pUpU形成的磷酸二酷键与基因组RNA结尸乙卜5’UTR通常折叠成多个特异性的空间结构，这些结构通过与宿主细胞蛋白因子结合，进而在起始病毒基因组RNA的合成以及病毒蛋白的翻译过程中发挥重要作用，此外，5’UTR结构还涉及病毒的宿主范围和病毒的毒力等多个方面的功能。EV71病毒基因组3’UTR区和多聚腺昔酸尾对病毒的感染性有重要作用[川。5’UTRPl飞 PZP33叫卜~~~~..~......归、司卜...-~~~~~卜月卜..............H可可石厅一:}刁刁丁同才才一丽一〕一一。1.州”2，以沁彩助4
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R373

【共引文献】