hHCN2基因转染293t细胞用于构建生物心脏起搏器的基础研究

发布时间：2019-09-23 14:05

【摘要】：背景：研究证实超极化激活环化核苷酸门控通道HCN (hyperpolarization-activated, cyclic nucleotide-gated)电流在调控心脏的自发搏动中起着非常重要的作用。 目的：观察HCN2基因重组质粒转染后的293t细胞中目的基因在核酸和蛋白质水平的表达。 方法：1、以脂质体转染试剂Lipofectamine 2000将含全长hHCN2基因的质粒CMV-hHCN2-3xHA-IRES-EGFP转染至293t细胞中。2、通过逆转录PCR和实时荧光定量PCR分别定性定量地检测hHCN2在核酸水平上的表达。3、通过Western-blot定性地检测hHCN2在蛋白水平的表达。 结果：1、用脂质体转染试剂Lipofectamine 2000成功地将质粒CMV-hHCN2-3xHA-IRES-EGFP转染至293t细胞中。2、逆转录PCR定性地检测到在100bp-250bp处可见高度特异DNA的条带,与携带HCN2基因的质粒扩增出的片段位置相同。实时荧光定量PCR定量地检测到实验组与对照组之间比较统计学差异非常显著(P=0.006),且实验组的hHCN2 mRNA的表达量较对照组高,实验组hHCN2 mRNA的表达量是对照组的2倍多,但不到4倍。3、Western-blot定性地检测hHCN2蛋白水平的表达,与HCN2蛋白的分布相符合。且转染组的表达水平明显高于未作处理组及对照组。 结论：质粒CMV-hHCN2-3xHA-IRES-EGFP成功转染后的293t细胞中hHCN2基因可以在核酸和蛋白水平表达。
【图文】：

六、RT一PCR定量检测hHCNZmRNA的表达。实验结果:循环曲线图所示(图8):取实验组、对照组中各引物扩增反应产物的量相同时的循环数Ct数据分析:实验组循环数X士S口为22.59土0.37，对照组循环数X士SD为23.99士0.28;实验组内参循环数x士sD为2327士0.19，对照组内参循环数x士人口为23.093士0.12;两两样木均数之间作比较用t检验，所有统计计算由SPSSIO.0软件完成。实验组与对照组之间比较尸=0.006<0.01，统计学差异非常显著，说明在获得相同量的反应产物时实验组循环数较对照组少，从而说明实验组的hHCNZmRNA的表达量较对照组高，Ct值均数相差大于1且小于2，，说明实验组的hHCNZmRNA的表达量是对照组的2倍多，但不到4倍;而实验组内参与对照组内参之间比较P=O.241>0.05无统计学意义，说明在获得相同量的反应产物时实验组循环数与对照组之间无明显差异，从而说明实验组内
【学位授予单位】：昆明医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R541.7;R329

【参考文献】

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本文编号：2540338