重组结核疫苗传代稳定性分析与MVA-tPA-Ag85B-ESAT6的构建及免疫原性研究

发布时间：2019-09-26 12:45

【摘要】：结核病是一种重大传染性疾病，因为其致病菌结核杆菌抵抗力、耐药性、休眠特性等，治疗肺结核一直是一个难题。唯一的肺结核疫苗卡介苗（BCG）是结核杆菌的减毒株，现在广泛用于新生儿的单针免疫，许多研究显示BCG对新生儿保护力较好，但对于成人的保护力从0%-80%不等。目前的新型基因工程疫苗，一般以BCG或rBCG进行初次免疫，以减毒活疫苗，病毒载体疫苗（痘病毒，腺病毒），蛋白疫苗，核酸疫苗等进行加强免疫。在诱导持续的强烈CD4+和CD8+细胞免疫应答反应，以及Th1细胞因子（尤其是IFN-γ）分泌方面，无论对于全菌体疫苗还是亚单位的疫苗，都是一个重大的挑战。结核杆菌有很多分泌性抗原：如Ag85B是一种分泌蛋白，属于分枝菌酸转移酶家族，其家族有三个组分，Ag85A，85B，85C，其中85A、85B已经经研究显示出较高的免疫原性，而且在小鼠模型和豚鼠模型中具有较好的免疫保护力。ESAT6是RD区的基因，在BCG中缺失，但是在结核杆菌中存在。很多研究都致力于BCG中缺失的片段，，以期恢复其完整的免疫原性。现在广泛研究的6Kd早期分泌蛋白ESAT6可以引起激活T-cell干扰素γ分泌的抗原。Ag85B、ESAT6都是抵抗结核杆菌侵染的主要保护性抗原，两种基因的融合，可扩大免疫原性范围，并已经证实在动物模型中有较强的免疫原性及保护力。本研究意义在于：第一，将本室研究的rAD，rMVA，rBCG按疫苗生产中传代稳定性的要求完成检测，以保证一定代次内疫苗的质量要求。第二，引入人组织型纤溶酶原激活因子前导信号肽tPA融合在目的片段N端，引导外源蛋白出膜，同时提高外源蛋白表达量。第三，利用MVA-tPA-Ag85B-ESAT6免疫小鼠，以期提高抗原免疫原性，甚至保护力的增加，为病毒载体疫苗研究做一定铺垫。本研究内容如下：第一部分：实验研究将本室制备的MVA-Ag85B-ESAT6在BHK-TK-细胞系中传代20次，AD-Ag85B-ESAT6在293细胞系中传代20次，以及BCG-Ag85B在苏通培养基中传代20次，Westernblot检测蛋白表达验证蛋白表达水平的稳定，提取基因组PCR扩增验证基因没有丢失，没有野生型污染，并测序验证基因没有发生回复突变。实验结果证明三种结核疫苗稳定性较好，可达到生物制品质量要求，在20代次内可以应用。第二部分：设计人源密码子偏好序列（定义为真核序列），以及天然序列（定义为原核序列）Ag85B-ESAT6，融合tPA信号肽后并构建重组pcDNA3.1(-)转染293T、BHK-TK-细胞检测蛋白表达结果，证明在pcDNA3.1(-)载体上，由tPA引导的序列可成功于BHK-TK-细胞系和293T细胞系的细胞内和细胞外提高外源蛋白表达量2-10倍，进而证明tPA的引导蛋白出膜作用和提高蛋白表达量的作用。第三部分：选择降解最少、糖基化最少、表达量较高的tPA-Ag85B-ESAT6(原核)序列构建的重组pSC11M1质粒与空MVA重组进行病毒筛选，筛选出阳性克隆MVA-tPA-Ag85B-ESAT6并大量扩增后密度梯度离心纯化，检测滴度，与PBS、MVA-blank、MVA-Ag85B-ESAT6同时皮下免疫BALB/c小鼠，检测细胞免疫和体液免疫效果。结果显示，MVA-tPA-Ag85B-ESAT6免疫后在细胞免疫方面，脾细胞被MHCI类限制性表位肽刺激后分泌IFN-γ的能力有很大提高，以及针对MVA载体本身的非特异性应答提高，细胞免疫呈Th1倾向且免疫1week时有CD8激活亚群比例的提高，体液免疫中IgG抗体水平只有小幅度提高。经过蛋白抗原刺激的脾细胞并没有在细胞因子IL-2和GM-CSF分泌上体现明显的提高趋势，仅与无tPA的MVA水平相当。这些结果证实了MVA-tPA-Ag85B-ESAT6在小鼠中免疫一周时达到一个免疫应答的峰值，一定程度上提高了免疫原性。本研究为tPA修饰的MVA病毒载体疫苗研究做了一定的铺垫，但是tPA具体作用机制、tPA修饰的病毒载体疫苗保护力如何以及更体系化的免疫实验有待进一步研究。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R392.11

【参考文献】