蒙古羊羊水源干细胞的分离鉴定及其定向成骨分化研究

发布时间：2019-09-29 06:25

【摘要】：本研究旨在分离鉴定蒙古羊羊水源干细胞(Amniotic fluid-derived stem cells,AFSC),并对其生物学特征及分化潜能进行探究,为以AFSC为种质资源生产克隆羊、转基因羊奠定理论基础。 经过培养不同孕期蒙古羊AFSC,发现羊水采集时间对AFSC的贴壁率及细胞活性影响较大,孕中期AFSC贴壁率比孕早期的高,细胞活性比孕晚期的强,采集AFSC的最佳时期为孕中期。 15% FBS可维持孕中期蒙古羊AFSC增殖50代以上,其形态及生物特性保持不变,细胞生长速度及增殖能力无明显差异。 细胞培养初期,通过机械分离法,并有效配合胰蛋白酶消化时间,去除成纤维状细胞中混杂的上皮样细胞,可在5代之内纯化。纯化的AFSC形态上为梭型,细胞汇合有方向性,集落呈典型涡旋状排列。 利用RT-PCR检测不同代数AFSC,结果表明蒙古羊AFSC表达干细胞标志基因Oct-4, Nanog, SH2, SSEA-1, CD117和HLA-A等。 蒙古羊AFSC悬浮培养时,可形成典型的类胚体,并表达三胚层标志基因fgf5 (外胚层)、α-fetoprotein (内胚层)和ζ-globin (中胚层)。 利用地塞米松、抗坏血酸、β-甘油磷酸钠对蒙古羊AFSC诱导后细胞生长相对变缓,边缘变模糊,局部出现复层生长,并形成颗粒状结节。诱导三周后细胞碱性磷酸酶活性显著增加,茜素红染色呈红色,表明诱导成功。 研究结果表明本试验从蒙古羊羊水中分离得到的细胞具有一定的干细胞特性,在体外有很强的增殖和分化能力,并在特定条件下可形成成骨细胞。
【图文】：

图 1 AFSC 的体外分离培养[39]Fig.1 The isolation and culture of AFSC in vitro研究者从怀有男婴的羊水中获取的 AFSC 分析发现染色体为 XY 型，这C 来源于胎儿而非母体[24,40]。2003 年有人提出孕期羊水中含 Oct-4 阳性细能是多能干细胞，以后的几年里 AFSC 的研究热度一直没减，但至今还没完善的 AFSC 培养体系。在 ESCs 的培养中经常采用小鼠成纤维细胞为饲

3 结果3.1 AFSC 细胞形态原代AFSC贴壁生长较慢，初次传代时间在6～7 d。传代后生长速度加快，传代比例为1：3时需每3～4 d传一次，比例为1：2时需每2 d传一次。初次培养时，可观察到梭形的成纤维细胞集落中有多角形的上皮样细胞集落混杂（图2.a）。贴壁细胞浓度不高时集落之间不接触，可通过细胞刮反复将上皮样细胞集落刮除，从而初步纯化成纤维状AFSC。传至5代左右后，上皮样细胞逐渐减少甚至消失，，以成纤维状细胞为主，当细胞汇合时排列有方向性，集落呈涡旋状，辐射状排列（图2.b）。
【学位授予单位】：内蒙古农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R329

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本文编号：2543742