靶向免疫细胞的脂质载体的研究

发布时间：2019-10-17 03:07

【摘要】：在过去几十年的脂质体有各种医疗应用，包括分子成像，药物输送，以及靶向性治疗。脂质体表面积大，结构具有弹性，有很大的修饰改良的潜力，其在体内的药代动力学表现出独特的性质。传统脂质体易被网状内皮系统吞噬，通过EPR效应实现被动靶向到肝脏，肺等特定组织；长循环脂质体经过高亲水双性分子的修饰，使得脂质体能够逃避RES的吞噬，延长其在血液中的循环时间，增加药物释放时间和作用时间，但缺乏靶向性，需要对脂质体表面进行额外的靶向配体修饰。目前，针对淋巴细胞的的靶向脂质体研究甚少，而在多种疾病中，治疗的失败往往是由于淋巴系统中隐匿的病灶，由于淋巴系统不同于其他身体器官，使得常规脂质体不能达到有效药物剂量，又或者因为限制性毒性不能达到治疗效果。本研究的重点是采用人工筛选的靶向配体多肽或者由免疫细胞自身剪切的多肽，对淋巴细胞形成靶向，构建淋巴系统靶向的脂质体，使其特异性的作用于淋巴细胞，达到治疗或者预防的效果。在人工筛选多肽配体的脂质体研究中，我们根据CD40/CD40L这一对与自身免疫疾病相关的通路，针对CD40L设计多肽配体，期望借助这配体实现对CD40/CD40L信号通路的阻断，同时对此通路中过度活跃的T细胞实现靶向杀伤。而隐形脂质体作为多肽配体展示以及细胞毒性药物的载体已经有大量的研究，我们结合筛选到的特异性配体，辅以细胞毒性药物，使用脂质体作为两者的载体，使其同时能够完成通路阻断和T细胞靶向杀伤的效果。我们使用计算机辅助模拟，确定受体和配体作用位点，筛选出具有与配体结合潜能的候选肽。后续使用表面等离子共振技术，对计算机虚拟筛选得到的候选多肽进行分子层面筛选。如此得到的多肽，我们再进行细胞层面的结合力筛选，最终确定个靶向多肽来进行CD40L+T细胞靶向毒性的体外和体内实验。实验结果表明，此多肽修饰的脂质体确实可以介导体外CD40L+T细胞的靶向杀伤，同时在对CD40/CD40L信号通路过度活化造成的动物疾病模型的治疗中，多肽修饰的脂质体与非靶向脂质体相比也表现出了较好的治疗效果。在天然表位肽制备脂质体的研究中，我们利用抗原呈递细胞中MHC-II类分子呈递抗原的过程，将抗原蛋白自然剪切成T细胞表位多肽。目前的研究，只能通过人工洗脱得到这些肽段或者计算机模拟后经过化学合成得到表位肽，费时费钱。而我们的研究则将此天然剪切的T细胞表位肽作为整体，通过脂质体重新组装抗原呈递细胞上含有MHC-II分子和表位肽的膜片段，考察这复杂的黑箱系统是否能对下游T细胞进行活化，引起机体的免疫反应。由于脂质体是膜蛋白的良好载体，所以使用脂质体可以很好的保持MHC-II分子和表位肽的生物活性，同时脂质体还是个类细胞系统，使得其装载细胞膜片段后能够实现部分膜蛋白的功能。在此项研究中，我们使用OVA作为模式抗原蛋白，树突状细胞作为模式抗原呈递细胞，通过体外活化的方法使得OVA经过自然剪切产生OVA表位肽，而此表位肽是与树突状细胞上的MHC-II分子结合在一起的。后续提取这表位肽/MHC-II复合物，利用脂质体作为载体，制成靶向CD4+T细胞的表位肽免疫脂质体。该脂质体在体外可以促进MF2.2D9T细胞株分泌IL-2，并且诱导原代CD4+T细胞增殖。将其回输体内，可以引起OVA特异性的体液免疫。经此脂质体免疫后的小鼠，可具有针对OVA的抗肿瘤特性，经分析该抗肿瘤效果是体液免疫和细胞免疫的共同作用结果。说明我们制备的自然剪切的表位肽T细胞靶向脂质体保持了定免疫学活性，并且可以作为种预防性肿瘤疫苗使用。
【图文】：

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细胞在进步的成熟和分化过程中，因为所处环境不同通过各种细胞因子介导控分化成不同的细胞亚类型。CD4+ T 细胞与抗原呈递细胞相互作用时，经过个信号通路（TCR/MHC 以及 CD28/B7）的刺激，进入细胞因子和相应的细胞因受体低表达的状态。最终这些细胞因子所形成的微环境决定细胞分化成那种亚胞类型。通过信号转导和活化转录分子 4（STAT4）的激活作用，（白介素 12）12 会加强干扰素γ（IFN-γ）的产生，然后再通过 STAT1，增加了转录因子 T-的表达。而 T- bet 又会增加 IL-12 和 IFN-γ的表达，抑制 IL-4 的表达，最使得 T 细胞朝着 Th1 亚细胞类型分化。在另外种情况下，IL-4 通过 STAT加 GATA 结合蛋白 3 (GATA3) 的表达，GATA3 又会增强 IL-4 的表达，抑制的表达，最后使得最终使得 T 细胞分化为 Th2 亚细胞类型。如图 1（图片来源维基百科网页）所示，CD4+ T 细胞最终分化成 Th1 和 Th2 亚细胞群，而这两细胞又行使着不同的免疫学功能[2]。

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博士学位论文般说来，个初始 CD8+ T 细胞能产生约 10000 个子细胞。这些新生的细胞表现出不同的效应功能，如分泌细胞因子或具有细胞毒作用。但这些细胞的存在是较为短暂的，有 90-95％在扩张阶段后很快死亡。其余 5-10％的 CD8+ T 细胞存活寿命较长，是记忆型 CD8+ T 细胞[18]。这些记忆 CD8+ T 细胞还分布在外周组织中，，它们可以作为效应细胞之外，还组成供针对病原体再次感染的第防线。它们可以以非抗原依赖型的模式迅速的募集到炎症部位，对携带同源抗原的病原体进行的抵抗，保护机体。1.3 T 细胞活化通路
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R392

【共引文献】