幽门螺杆菌sabA基因的克隆表达及江西地区幽门螺杆菌外膜蛋白的序列特征

发布时间：2019-10-24 05:32

【摘要】：研究背景与目的：外膜蛋白与H.pylori的定植、胃黏膜的损伤、炎性介质的分泌和中性粒细胞的浸润等有着密切关系，同时它是激发免疫反应的主要成份，可诱导强大的菌株特异性免疫反应，这在H.pylori的致病中起重要作用。H.pylori感染后的转归主要受细菌因素、宿主因素和环境因素三者的影响，其中细菌因素在H.pylori感染结局的多样性中起重要作用，H.pylori毒力因子的基因多态性也是重要原因。以往对H.pylori毒力的研究多集中在尿素酶、细胞毒素相关蛋白（Cag）、空泡毒素（VacA）等方面上，而近年来的研究发现H.pylori外膜蛋白与其定植、炎性介质的分泌、胃黏膜的损伤和中性粒细胞的浸润等有着密切关系。为了研究H.pylori疫苗的候选抗原成分和更好的防治H.pylori感染，本文将构建H.pylori外膜蛋白唾液酸结合黏附素（SabA）的重组质粒并检测其体外表达重组蛋白的抗原性和分析来自江西临床H.pylori菌株的前炎性外膜蛋白A(outerinflammatory protein A, OipA)、血型抗原结合黏附素(blood-group antigenbindingadhesion, BabA)、唾液酸结合黏附素(sialic acid-binding adhesion, SabA)的基因序列特征，并与来自东亚和非东亚地区的22株H.pylori的序列进行比对，分析不同区域的序列特征。探明我国外膜蛋白的基因特征对于研究其与疾病的关系具有重要意义以及为SabA作为靶抗原的研究奠定了基础。方法： 1.幽门螺杆菌唾液酸结合黏附素的克隆表达：（1）以H.pylori26695株基因组为模板，设计sabA基因特异性引物扩增目的基因；（2）将PCR产物插入到pGEX-4T-1载体构建重组质粒，在大肠杆菌BL21中诱导表达；（3）表达蛋白经飞行质谱鉴定，并用免疫印迹法评价其抗原性。 2.幽门螺杆菌外膜蛋白（OipA、BabA、SabA）的基因序列特征分析：（1）对前期分离的154株临床H.pylori菌株进行复苏培养，并提取其基因组DNA；（2）针对H.pylori外膜蛋白（OipA、BabA、SabA）设计多对特异性全长测序引物；（3）进行目的基因的扩增，并将其产物送于公司测序；（4）利用生物信息学软件MEGA、AlignX、ClustalX2和相关信息数据库进行DNA序列、氨基酸序列比对，分析江西地区的序列特征。（5）将江西临床菌株序列与来自不同区域的22株H.pylori菌株序列进行比对，分析不同区域的序列特征，找出江西地区菌株序列的特异性。结果： 1.幽门螺杆菌唾液酸结合黏附素的克隆表达结果：（1）获得H.pylori26695的唾液酸黏附素基因，并经酶切鉴定基因sabA成功插入到pGEX-4T-1载体中。（2）重组质粒pGEX-4T-1-sabA在大肠杆菌BL21中表达，经飞行质谱鉴定为幽门螺杆菌外膜蛋白SabA，且该蛋白具有抗原性。 2.幽门螺杆菌外膜蛋白（OipA、BabA、SabA）的基因序列特征分析结果：（1）扩增出临床菌株外膜蛋白的OipA、BabA、SabA三个基因，且多对引物PCR的三个基因阳性率均为100%。根据DNA序列翻译成氨基酸的方法，预测外膜蛋白OipA的蛋白质表达阳性率为99.33%，BabA和SabA的蛋白质表达阳性率分别为75.89%和61.90%。babA基因序列有52.43%的碱基位点发生突变明显高于sabA基因序列的49.28%，而翻译成的氨基酸序列后，babA氨基酸序列有42.38%的氨基酸位点发生突变明显低于sabA氨基酸序列的46.96%，说明babA的碱基位点突变多数为同义突变，DNA序列的变化不影响氨基酸的变化。（2）DNA序列比对聚类分析结果： ①oipA基因中有257个碱基点发生了突变，占基因全长的27.81%，与不同地区的菌株序列比对发现江西地区的菌株序列CT重复数不明显。将序列聚类可分为七大类，其中来自非东亚地区的菌株序列聚为一个小类，而来自东亚地区的菌株序列却分别与江西菌株序列聚为不同的小类。 ②babA基因中有1209个位点碱基发生突变，占基因全长的52.43%，比对发现babA整个基因基因序列在600～1100位点存在一个高突变区域。将序列聚类大致可以分为两类，其中来自非东亚地区的菌株序列聚为一个类别，而来自韩国的菌株序列却聚为一个小类，来自日本的菌株序列分别与江西菌株序列聚为不同的小类。 ③sabA基因中有1021个碱基位点发生了突变，占全长基因的49.28%，比对发现sabA整个基因序列在0～100、200～1200位点存在两个高突变区，与不同地区的菌株序列比对发现江西临床菌株序列不存在CT重复序列。将其聚类可以分为两个大类，来自东亚地区的菌株序列与江西菌株序列聚为不同的小类。（3）氨基酸序列比对聚类分析结果： ①oipA氨基酸序列中有81个位点氨基酸发生了突变，占全长氨基酸序列的26.30%，其等电点在9.42～10.03之间，平均值为9.62；不稳定指数在16.12～23.81之间，平均值为18.91；脂肪指数在77.30～82.11，平均值为79.73；亲水值在－0.385～－0.255之间，平均值为－0.341。将所有推测出的氨基酸序列进行比对聚类分析，此聚类图显示根据氨基酸的变化将氨基酸序列大致分为七类，和DNA序列聚类是对应的。 ②babA的氨基酸序列中有317个位点氨基酸发生了突变，占全长氨基酸序列的42.38%，其等电点在6.15～11.00之间，平均值为9.18；不稳定指数在－1.86～43.61之间，平均值为21.59；脂肪指数在0～92.08，平均值为67.21；亲水值在－1.575～0.020之间，平均值为－0.426。将所有推测出的氨基酸序列进行比对聚类分析，大致可以分为三个大类，其中142号菌株的氨基酸序列和其他菌株的氨基酸序列有着很大的差异性。 ③sabA的氨基酸序列中有1021个位点氨基酸发生了突变，占全长氨基酸序列的46.96%，其等电点在4.93～12.31之间，平均值为9.29，不稳定指数在7.66～62.90之间，平均值为31.37；脂肪指数在71.78～149.41，平均值为90.60；亲水值在－0.761～1.200之间，平均值为－0.181。将所有推测出的氨基酸序列进行比对聚类分析，，大致可以分类两个大类。结论： 1.成功克隆了H.pylori的SabA，并能在大肠杆菌BL21中表达，该蛋白具有良好的抗原性。 2.我国临床菌株序列的oipA、babA和sabA DNA序列检测的阳性率明显高于其他国家和地区。 3.序列比对聚类发现我国临床菌株序列存在着多态性，不同地区的菌株序列有着不同的特征，而我国菌株序列与东亚地区比较接近，与非东亚地区差异比较大。
【图文】：

物理图谱,物理图谱,表达质粒,公司

4图 2.1 表达质粒 pGEX-4T-1 物理图谱Figure 2.1 Expression plasmid pGEX-4T-1 physical mapamH I 和 Xho I TaKaRa 公司(China)DNA 连接酶 TaKaRa 公司(China)i BL21(DE3) 天根生化科技有限公、dNTP 天根生化科技有限公天根生化科技有限公天根生化科技有限公PTG 天根生化科技有限公i Plasmid Kit 天根生化科技有限公

产物,酶切鉴定,条带

图 2.2 PCR 产物凝胶电泳分析dder Marker；2：阴性对照；3：PCR 扩增 sabA 产物gure 2.2 Agarose gel electrophoresis analysis of PCR prodder Marker；2: Negative control；3: sabA of PCR produc粒的酶切鉴定 pGEX-4T-1-sabA 经 BamHⅠ和 XhoⅠ双酶切的条带，分别约为 4 969bp（pGEX-4T-1）和 1图 2.3），证明重组质粒构建成功。
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R378

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