尿路缺损肌性管腔修复的种子细胞实验研究

发布时间：2019-10-25 19:30

【摘要】：第一部分:Beagle犬脂肪干细胞原代培养及诱导成肌细胞的实验研究目的:验证犬脂肪干细胞(ADSCs)原代培养及诱导成肌细胞方法的可行性,并为肌性管腔的构建提供可靠的种子细胞。方法:取雄性Beagle犬腹股沟处皮下脂肪组织,使用酶消化法行原代脂肪干细胞培养,并对所培养的ADSCs表面标志进行流式细胞仪鉴定;取第1代培养至对数生长期细胞分为实验组A和对照组B两组,诱导剂为10umol/L的5-aza,每日倒置显微镜下观察细胞形态变化,并在诱导的第7,14,21,28天行细胞免疫荧光和流式细胞仪检测其特异性成肌细胞特异性抗原desmin和myosin的表达情况。结果:成功从犬腹股沟部皮下脂肪组织分离、培养出ADSCs,相关表面抗原表达检测证实其干细胞特性。倒置显微镜下观察细胞形态变化显示:诱导组细胞诱导3周出现成肌细胞特有的“漩涡”样生长形态,在诱导的第4周单个细胞表现出多核化;免疫荧光和流式细胞仪检测显示:desmin和myosin的表达率在诱导28天时达最高,分别为59.4%和56.1% ,而诱导前和对照组细胞均呈阴性表达。结论:本实验进一步证明了脂肪干细胞可通过诱导向成肌细胞方向分化,为下一步实验提供了可靠的种子细胞。第二部分:Beagle犬上皮细胞原代培养及鉴定的实验研究目的:探讨犬上皮细胞的原代培养方法的可行性,并为尿路肌性管腔粘膜上皮提供可靠的种子细胞。方法:取雄性Beagle犬口腔黏膜上皮组织,使用酶消化法行上皮细胞原代培养,使用3T3细胞作为细胞饲养层,细胞生长至培养皿80%左右行传代处理;每日倒置显微镜下观察细胞形态变化;取第一代生长至对数期细胞行细胞免疫荧光和流式细胞仪鉴定表皮细胞标志蛋白AE1/AE3的表达情况。结果:上皮细胞生长较缓慢,原代需培养20天方能达到100mm培养皿的80%左右,传代后生长速度明显加快,一般10天就能达到100mm培养皿的80%;细胞鉴定采用国际上上皮类组织比较常用的AE1/AE3来鉴定,荧光及流式结果让人满意。结论:本实验进一步证明了上皮细胞可通过原代培养获得,可作为下一步实验可靠的种子细胞。
【图文】：

细胞分布,原代培养,光镜,细胞

3 结果3.1 光镜下细胞形态记录：ADSCs原代培养48小时后可观察到少量贴壁细胞， 72小时可见更多细胞贴壁并呈现“集落样生长”（图1）。取诱导前及空白组培养1周的ADSCs细胞光镜观察可见细胞呈短梭形，，40倍光镜下可见细胞分布均匀、形态较一致,高倍镜下见细胞呈短梭形、单核（图2、图3）。取培养3周的A组细胞光镜观察细胞形态，可及A组中“成肌细胞”在3周时增多，细胞初步呈现“漩涡状”生长（图4），同时期B组细胞变化不大（图5）；取培养4周的A组细胞光镜下可及细胞“漩涡状”生长更明显，并呈现成肌细胞的“多核化现象”（图6）。3.2 流式细胞仪ADSCs细胞鉴定：取培养至第1代处于对数生长期细胞行干细胞相关指标CD90和CD105鉴定，行CD34鉴定排除造血干细胞污染，结果示：高表达CD90和CD105

光镜,细胞,原代培养,组培

图1原代培养48小时的ADSCs40倍光镜图图2.第一代培养7天的ADSCs100倍光镜（primary culturefor 48 h ( ×40)）图（passage 1 for 5 days（×100））图3. 第一代培养7天的ADSCs细胞200倍图4.A组培养3周的细胞100倍光镜图光镜图（passage 1 for 5 days（×200））（Agroup cells induction for 3weeks ( ×100)）
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R329;R699.6

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