hUCB-MSCs在大鼠视神经急性损伤中的抗凋亡与促进再生的实验研究

发布时间：2019-11-10 08:45

【摘要】：视神经损伤在临床很常见，很多眼科疾病都会导致视神经损伤，最终导致视力下降甚至失明，视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells，RGCs)的逐渐死亡是视神经损伤后视觉障碍不可逆转的一个重要原因，目前临床上尚无有效的治疗方法。与中枢神经系统损伤类似，视神经受损伤后，即有部分细胞坏死，残存的神经细胞因缺血、兴奋性神经递质释放、钙超载、炎症反应等继发性损伤而逐渐发生凋亡或死亡。经典理论认为成年哺乳动物的视神经损伤后是有再生反应，但却无再生能力。轴突损伤后，RGCs早期发生再生支芽，但不久就萎缩了，是“失败”的再生。最近一二十年的基础研究和动物实验证明只要给予适当的内外微环境，视神经轴突在损伤后是可以再生的，因此促进受损的RGCs修复和再生是目前眼科研究的一个热门话题。干细胞的发现为细胞替代治疗和促进神经修复带来了希望，但以往胚胎干细胞和神经元干细胞的应用涉及伦理道德的限制而影响其的应用。目前应用最多的是间充质干细胞，间充质干细胞来源于发育早期的中胚层和外胚层，具有多项分化能力、造血支持、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注，并且在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为软骨、脂肪、骨、肌肉、神经等多种组织细胞，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复，是组织工程研究中较为理想的种子细胞。近几年来间充质干细胞一直被用于脊髓、脑缺血损伤等中枢神经系统疾病的研究，研究显示间充质干细胞具有一定的神经保护作用。本研究拟建立SD大鼠视神经急性钳夹损伤模型，并用人脐带血间充质干细胞(human umbilical cord blood mesenchymal stem cells,hUCB-MSCs)移植到大鼠的眼玻璃体腔内，探索hUCB-MSCs对大鼠急性视神经损伤的抗凋亡与促进神经再生的作用，为将来弥补现有临床治疗手段的不足奠定实验基础，这对神经眼科学的发展和眼科临床都有重要意义。本课题研究包括两部分，第一部分细胞实验（hUCB-MSCs的分离、纯化和鉴定）：采用密度梯度离心法和贴壁法从人脐带血中分离提纯间充质干细胞并鉴定。第二部分动物实验（玻璃体腔内移植hUCB-MSCs对大鼠急性视神经损伤的抗凋亡与促进神经再生作用）：将动物分为治疗组、对照组和正常组，用荧光金（Fluorogold FG）逆行示踪标记SD大鼠视神经急性损伤模型的RGCs并计数；苏木素-伊红（HE）染色观察视神经急性损伤后和间充质干细胞移植后视网膜的形态学变化；免疫荧光，Western Blotting和Real-Time PCR分析神经轴突中生长相关蛋白43（growth associatedprotein43，GAP-43）蛋白的表达变化情况；免疫荧光和Real-Time PCR检测ATP配体门控嘌呤受体P2X7蛋白的表达情况；免疫荧光检测促凋亡蛋白Bax和抑凋亡蛋白Bcl-2、半胱氨酸蛋白酶Caspase-3蛋白的表达情况；Tunel原位检测细胞的凋亡水平等手段比较各组的差别。本研究的主要结果如下： 1．hUCB-MSCs体外分离纯化培养体外分离纯化的hUCB-MSCs与文献报道一致：光镜下呈双极状态，两个突起的长梭形或扁平形的成纤维样细胞。流式细胞仪鉴定为：CD13、CD29、CD44、CD105、CD90呈现强阳性，而CD34、CD45，HLA-DR则表现为弱阳性，证实为间充质干细胞。 2. SD大鼠大脑立体定位荧光金逆行示踪标记RGCs并计数无论对照组还是治疗组RGCs数目都是随时间逐渐递减的，但同一时间点下治疗组的RGCs数目都要比对照组多（P0.05）。 3. HE染色无论对照组还是治疗组4个时间点RGCs数目逐渐减少，视网膜各层排列逐渐紊乱，并出现畸形核，有的神经节细胞层出现长片段的细胞缺失，但治疗组每个时间点下RGCs的数目、视网膜各层的紊乱程度都要比对照组佳。 4. GAP-43蛋白的表达变化情况免疫荧光显示正常视网膜内各层GAP-43表达量极少，仅在内丛状层见很少量的表达，视神经损伤后于对照组见表达量稍增加，第7d和14d较明显，之后急剧下降；hUCB-MSCs移植治疗组于第7d和14d时GAP-43表达明显增加并达峰值之后开始下降。Western检测结果显示无论是对照组还是治疗组GAP-43蛋白表达第3d时和正常组的差异不大，第7d、14d蛋白表达明显增高，但第14d蛋白水平比7d组的蛋白表达略少，开始下降。但治疗组每个时间点下目的蛋白的表达水平的相对灰度值都要比对照组的高，这和免疫荧光检测结果相一致；Real-Time PCR显示目的基因GAP-43的mRNA水平治疗组于伤后第3d达到峰值，之后随着时间的延长急剧减少，第21d基因水平极低，与对照组和正常组差异明显（P0.01）；对照组于伤后第3d和正常组差异不明显（P㧐0.05），之后随时间延长急剧下降，第7d、14d与治疗组和正常组差异明显（P0.01），第21d和治疗组无差异（P㧐0.05）和正常组差异明显（P0.01）。 5.嘌呤能受体P2X7的表达变化情况免疫荧光显示P2X7的表达量于视神经损伤后随时间延长是逐渐增多的，但对照组的表达量明显比治疗组要高。P2X7的mRNA水平变化情况：对照组的mRNA水平于损伤后第3d开始增高，但和正常组、治疗组差异不明显（P㧐0.05），第7d开始和正常组有差异（P0.05），和治疗组差异不明显（P㧐0.05），之后急剧上升和治疗组、正常组差异明显（P0.01）；治疗组于损伤后第3d、7d、14d和正常组差异不明显（P㧐0.05）之后开始上升，第21d和正常组有差异（P0.05）。 6.促凋亡基因Bax、抑凋亡基因Bcl-2与Caspase-3的表达情况免疫荧光显示Bax的表达情况于视神经损伤后对照组和治疗组都随时间延长逐渐增多，但对照组的表达量比治疗组高；Bcl-2在对照组中第3d表达量很高，，随后逐渐降低，治疗组于第3、7、14d表达都很高，第21d稍降低；Caspase-3于视神经损伤后逐渐增多，但对照组的表达量要比治疗组高； 7．Tunel染色无论对照组还是治疗组随时间点凋亡细胞都逐渐增多，但治疗组每个时间点下凋亡细胞都要比对照组少。结论：hUCB-MSCs在大鼠视神经急性损伤中可能具有抗凋亡和促进再生的作用。
【图文】：

荧光金,逆行标记

图1：荧光金逆行标记五、视神经急性损伤模型的建立10％水合氯醛（0.3ml/mg）腹腔注射麻醉，俯卧位固定于鼠台上，在解剖显微下垂直于睑缘方向剪开上睑中部，直到眶上缘，沿 9 点-3 点钟位置剪开球结膜和部穹隆结膜，暴露并剪断上直肌，向下方牵拉眼球，分离视神经周围软组织并充分暴视神经。Yasargil 脑动脉瘤夹以 30g 的夹力于球后 2mm 处夹持视神经，注意 Yasar脑动脉瘤夹与视神经的长轴垂直，致伤时间为 30 秒，松开 Yasargil 脑动脉瘤夹后合球结膜，结膜囊内涂迪可罗眼膏。纳入标准：夹持后立即观察，如果大鼠伤眼瞳孔散大，直接对光反射消失，间对光反射存在，视网膜血管无出血或梗塞，伤后 5 分钟内血流完全恢复可纳入实验

动脉瘤夹,球后,视神经,荧光金

图1：荧光金逆行标记性损伤模型的建立ml/mg）腹腔注射麻醉，俯卧位固定于上睑中部，直到眶上缘，沿 9 点-3 点钟上直肌，向下方牵拉眼球，分离视神经瘤夹以 30g 的夹力于球后 2mm 处夹长轴垂直，致伤时间为 30 秒，松开迪可罗眼膏。立即观察，如果大鼠伤眼瞳孔散大，直血管无出血或梗塞，伤后 5 分钟内血
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R363

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