滚压载荷生物反应器及不同状态软骨细胞对兔骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的作用

发布时间：2019-11-11 20:56

【摘要】：软骨是一种半透明并且有弹性的组织,它的结构和功能平衡至关重要。一旦这种平衡被打破,软骨将会导致病变。关节软骨由于缺乏血管供应、神经支配、淋巴回流,损伤后难以进行修复。随着工程学、材料科学和细胞生物学的迅猛发展,用组织工程学技术体外制造具有生物学特性和功能的软骨组织成为解决这一难题最有希望的方法。骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem cells,BMSCs)由于来源方便,扩增快,目前被认为是软骨组织工程最佳的种子细胞。力学因素和生物化学因素在BMSCs向软骨细胞分化的过程中起关键作用。基于此,本课题分两部分来研究滚压载荷生物反应器及不同状态软骨细胞对兔骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的作用和不同状态软骨细胞在共培养系统下对骨髓间充质干细胞向软骨细胞诱导分化作用。 1滚压载荷生物反应器促进兔骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的研究目的观察滚压载荷生物反应器对BMSCs-琼脂糖复合体中BMSCs向软骨细胞诱导分化的作用。方法分离新西兰兔BMSCs,培养至第三代后与低熔点琼脂糖复合成凝胶块并在自制的模具中形成直径为4mm高为4mm的圆柱形胶块。将样本分为TGF-β1+力学组、TGF-β1组、力学组和对照组进行不同的处理。在第7、14、21天时去各组标本进行实时定量PCR、GAG含量检测以及组织学染色。结果TGF-β1+力学组II型胶原基因表达在第7、14、21天三个时间点随时间的推移逐渐增强,并在第21天时显著增强。第7天TGF-β1+力学组、TGF-β1组、力学组II型胶原基因表达分别上调2.5±0.24(P0.05)、1.8±0.12和1.9±0.20倍,蛋白聚糖基因表达分别上调2.7±0.34(P0.05)、2.6±0.06和2.1±0.07倍。而对照组II型胶原基因表达下调0.6±0.08倍,蛋白聚糖基因表达下调0.8±0.10倍。第14天TGF-β1+力学组、TGF-β1组、力学组、对照组II型胶原基因表达分别上调5.7±0.61(P0.05)、3.4±0.54(P0.05)、3.2±0.36和1.2±0.22倍,蛋白聚糖基因表达分别上调8.6±1.61(P0.05)、7.7±1.42(P0.05)、6.7±0.93和1.2±0.04倍。第21天TGF-β1+力学组、TGF-β1组、力学组、对照组Ⅱ型胶原基因表达分别上调7.1±1.21(P0.05)、4.9±0.89(P0.05)、5.6±0.92(P0.05)和1.4±0.08倍,蛋白聚糖基因表达分别上调14.3±1.81(P0.05)、9.7±1.12(P0.05)、10.5±0.90和1.6±0.08倍。TGF-β1+力学组蛋白聚糖基因在第21天时也较对照组显著增强并且高于其它两组。对照组的Ⅱ型胶原和蛋白聚糖基因在三个时间点均未见明显增强。TGF-β1+力学组、TGF-β1组、力学组、对照组的第7天的GAG含量分别为2.10±0.33、1.69±0.12、1.58±0.16、0.13±0.05μg/(mg湿重),第14天的GAG含量分别为3.56±0.32、2.33±0.25、2.64±0.085、0.20±0.04μg(/mg湿重),第21天的GAG含量分别为4.63±0.28、2.68±0.35、3.35±0.34、0.27±0.0118μg/(mg湿重)。TGF-β1+力学组GAG含量在三个时间点均明显升高(P0.05)并且均高于其余三组。TGF-β1+力学组标本甲苯胺蓝染色较其余各组明显蓝染,并有软骨陷窝样结构。结论滚压载荷生物反应器可以有效促进BMSCs-琼脂糖复合体中BMSCs向软骨细胞诱导分化。在结合TGF-β1后这种促进作用更加明显。 2不同状态软骨细胞在共培养系统下对骨髓间充质干细胞向软骨细胞诱导分化作用的研究目的观察不同代次正常软骨细胞和关节炎软骨细胞对琼脂糖-BMSCs的向软骨细胞分化的促进作用。方法分离新西兰兔BMSCs,正常软骨细胞。制作兔关节炎模型,提取兔关节炎软骨细胞。将BMSCs和低熔点琼脂糖复合成凝胶块,放在自制的六孔板网格架上,构建兔软骨细胞-BMCSs共培养系统。在3、7、14天取各组琼脂糖-BMSCs凝胶块进行实时定量PCR、GAG含量检测。结果兔关节炎模型制作成功,关节面色泽较灰暗,关节软骨粗糙。Normal P0-BMSCs组第3、7、14天Ⅱ型胶原基因表达分别为同时间点对照组的5.11±0.3、7.2±0.39、11.2±0.58倍,Ⅰ型胶原分别为同时间点对照组的0.25±0.2、0.75±0.35、1.05±0.48倍,蛋白聚糖分别为同时间点对照组的2.1±0.22、3.8±0.41、22.5±0.39倍。Normal P3-BMSCs组第3、7、14天Ⅱ型胶原基因表达分别为同时间点对照组的0.71±0.3、1.5±0.57、1.8±0.38倍,Ⅰ型胶原分别为同时间点对照组的0.92±0.13、1.2±0.33、1.8±0.30倍,蛋白聚糖分别为同时间点对照组的0.7±0.22、1.0±0.28、1.58±0.40倍。OA P0-BMSCs组第3、7、14天Ⅱ型胶原基因表达分别为同时间点对照组的1.0±0.37、1.73±0.74、3.6±0.36倍,Ⅰ型胶原分别为同时间点对照组的0.98±0.22、0.65±0.14、1.21±0.22倍,蛋白聚糖分别为同时间点对照组的0.95±0.15、6.2±0.68、7.8±0.44倍。OA P3-BMSCs组第3、7、14天Ⅱ型胶原基因表达分别为同时间点对照组的1.1±0.35、0.67±0.39、1.51±0.22倍,Ⅰ型胶原分别为同时间点对照组的0.4±0.12、0.6±0.4、0.8±0.13倍,蛋白聚糖分别为同时间点对照组的1.28±0.28、0.95±0.39、1.12±0.41倍。Normal P0-BMSCs组的Ⅱ型胶原基因表达随时间的增加明显增强,Normal P3-BMSCs组Ⅰ、Ⅱ型胶原及蛋白聚糖基因表达均未见明显增强,OA P0-BMSCs组蛋白聚糖基因表达明显增强,OA P3-BMSCs组Ⅰ型胶原基因表达水平在3个时间点均低于对照组。Normal P0-BMSCs、Normal P3-BMSCs、OA P0-BMSCs、OA P3-BMSCs组的GAG含量分别为5.7±0.49、2.3±0.41、2.5±0.31、1.8±0.59μg/(mg湿重)。OA P0-BMSCs组GAG含量与对照组相比差异无统计学意义(P0.05),其余三组与对照组相比差异均具有统计学意义(P0.05)。结论兔正常P0软骨细胞与兔关节炎P0软骨细胞所分泌的形态发生素能够有效促进BMSCs向软骨细胞分化,而兔正常P3软骨细胞的促分化作用微弱,兔关节炎P3软骨细胞不能促进BMSCs向软骨细胞分化。
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R329

【参考文献】