生殖支原体MgPa模拟表位的筛选与鉴定及其MAP免疫效果的观察

发布时间：2019-11-16 10:10

【摘要】：研究背景生殖支原体（Mycoplasma genitalium, Mg）是近年新明确的一种性病病原体，研究表明，Mg可能引起泌尿生殖道感染，与盆腔炎、呼吸道感染、关节炎等疾病有关，并可导致不育。另外，Mg还是引起艾滋病患者发生机会感染的主要病原体之一，被称为AIDS相关支原体。对于Mg的感染，目前仍然没有满足临床需要的疫苗可供使用，临床上急需安全、有效的疫苗以用于预防Mg的感染。生殖支原体粘附素蛋白（MgPa）是位于其尖形结构的一种主要的粘附素，其C端具有很强的免疫原性（最强区位于第1248～1364aa）。因此，MgPa是一种重要的中和抗原，在Mg的诊断和预防中起着重要的作用。本研究拟利用噬菌体展示随机肽库技术筛选MgPa的模拟表位，采用多抗原肽（MAP）的设计方案，制备并纯化含有模拟表位的八分枝MAP，并对其免疫原性进行研究。研究目的表达并纯化含生殖支原体MgPa优势表位（1075～1364aa的重组蛋白（rMgPa），制备并纯化rMgPa的多克隆抗体（pAb），以此pAb为靶分子，利用噬菌体展示随机12肽库筛选并鉴定MgPa的模拟表位，为研究MgPa的抗原表位结构提供实验依据；制备含有多个模拟表位的多抗原肽（MAP），检测其诱导小鼠产生特异性体液免疫和细胞免疫应答水平，为研制安全、有效的基于多个抗原表位的Mg表位肽疫苗奠定实验基础。研究方法（1）利用构建好的原核表达载体PET-30a(+)/MgPa在大肠杆菌中诱导表达MgPa的重组蛋白，并用ELISA、SDA-PAGE和Western blot等方法对其进行鉴定，再用Ni-NAT亲和层析柱纯化重组蛋白，用BCA法测定重组蛋白的浓度。（2）将经纯化的重组蛋白免疫新西兰兔以制备其相应的pAb，用饱和硫酸铵法和溴化氰活化的琼脂糖4B亲和层析柱纯化pAb，用间接ELISA法检测免疫兔血清中pAb的效价，再用Western blot鉴定pAb的特异性和免疫原性。（3）以此pAb为靶分子对噬菌体展示随机12肽库进行4轮生物淘洗，随机挑取经淘洗后的噬菌体克隆进行扩增培养，提取并纯化其单链DNA进行DNA测序分析，，推导出噬菌体表面展示的外源性氨基酸序列，并用MIMOX工具进行生物信息学分析。用ELISA、竞争性结合试验和Western blot等方法检测噬菌体与pAb结合的特异性。（4）以多聚赖氨酸为核心基质，人工合成含有筛选到的模拟表位的八分枝MAP，用反向高效液相色谱（RP-HPLC）分析MAP的纯度，再用质谱分析仪测定MAP的分子量以期对其进行鉴定。（5）将30只6～8周龄雌性BALB/c小鼠随机分为PBS组、WP组、AS组、KH组和混合组，将100L PBS或100g各种合成的MAP或其混合物分别经皮下多点注射免疫小鼠，共免疫4次，每间隔2w免疫1次。每次于免疫前1天剪尾取血，末次免疫后第14d摘眼球放血收集小鼠血清，无菌制备脾细胞悬液。（6）间接ELISA测定小鼠血清中的特异性IgG抗体及其亚类的水平；ELISA检测脾细胞培养上清中的IL-4和IFN-γ水平；MTT比色法检测小鼠脾淋巴细胞的增殖反应。研究结果（1）SDS-PAGE显示，IPTG诱导转化有PET-30a(+)／MgPa的大肠杆菌成功表达了一分子量约为37kD的含6×His的融合蛋白rMgPa，经Ni-NAT亲和纯化获得了较高纯度的目的蛋白，目的蛋白在菌体内主要以包涵体形式存在，BCA法测定经纯化的目的蛋白浓度达到1160μg/mL。（2）利用纯化的经复性后的rMgPa免疫新西兰兔后获得了相应的pAb，间接ELISA结果显示血清中特异性pAb的效价为1∶25600；Western blot的结果表明rMgPa能与免疫血清发生特异性结合；免疫血清经饱和硫酸铵法初步纯化，随后经亲和层析法纯化后得到具有较高纯度的抗rMgPa的pAb，SDS-PAGE分析的结果表明所制备的pAb的轻链分子量约为25kD，重链分子量约为50kD，因此，该pAb的分子量约为150kD。（3）以经纯化的抗rMgPa的pAb抗体为靶分子，对噬菌体展示随机12肽库进行了4轮生物淘洗，第一轮和第四轮生物淘洗的产率分别为1.45×10-6和9.25×10-4，说明特异性噬菌体克隆得到了明显富集；经对45种不同的肽序列进行比较分析以及用MIMOX进行生物信息学分析，结果表明45个肽序列中的3组一致性的核心序列分别为： P-S-A-A/V-X-R-F/W-E/S-L-S-P,A-K-I/L-T/Q-X-T-L-X-L和K-S-L-S-R-X-D-X-I。（4）ELISA实验的结果显示：45个含不同肽序列的噬菌体克隆中，共有36个为阳性噬菌体克隆，其中23个噬菌体克隆有较高的结合力，其A450值均高于1.5；竞争性结合试验的结果表明，这些噬菌体与pAb的特异性结合能被不同浓度的rMgPa部分抑制，且随着其浓度的增加其抑制效果也相应的增加；Western blot方法检测的结果表明A450值高于1.5的23个阳性噬菌体能与pAb发生特异性结合。（5）反向高效液相色谱分析的结果表明合成的3个MAP的纯度都在90%以上，质谱分析的结果说明所合成的MAP的分子量与预期的理论分子量基本一致，因此，成功地合成了较高纯度的3个模拟表位的MAP。（6）小鼠经4次免疫后，WP组、AS组、KH组和混合免疫组血清中IgG抗体的A450值分别为0.935±0.028、0.640±0.022、0.841±0.103和1.326±0.025，与PBS对照组（0.118±0.023）比较，均具有统计学意义（p0.01）；与WP组、AS组和KH组相比，混合免疫组小鼠血清中IgG抗体的A450值升高更为明显（p0.05）。（7）WP组、AS组、KH组和混合免疫组的IgG抗体效价分别为1∶2560、1∶640、1∶2560和1∶5120。WP组、AS组、KH组和混合免疫组小鼠血清中的IgG抗体以IgG2a型为主，其相应的IgG2a/IgG1分别为1.835±0.125、1.708±0.180、1.690±0.202和2.095±0.179，均显著高于PBS组（0.967±0.142）（p0.01）。（8）WP组、AS组、KH组和混合组的IL-4含量分别为55.588±2.407、42.996±1.935、54.754±2.270和81.598±2.649pg/mL，与PBS组（16.673±1.662）相比，具有统计学意义（p0.01）。与WP、AS、KH组相比，混合组产生的IL-4水平具有显著性差异（p＜0.01）。（9）WP组、AS组、KH组和混合免疫组的刺激指数（SI）分别为1.560±0.036、1.353±0.131、1.424±0.041和1.874±0.060，明显高于PBS组（1.107±0.032，p0.01）；混合免疫组的刺激指数（SI）显著高于WP组、AS组和KH组（p0.01）。（10）WP组、AS组、KH组和混合免疫组的IFN-γ含量分别为168.496±7.919、98.327±5.030、111.437±5.243和235.815±8.430pg/mL，显著高于PBS组（31.476±1.717，p0.01）；且与WP组、AS组、KH组相比，混合免疫组的脾淋巴细胞产生了更多的IFN-γ（p0.01），差异具有统计学意义。结论（1）成功表达并纯化了分子量为37kD的重组蛋白rMgPa；（2）成功制备并纯化了高效价、高特异性的兔抗rMgPa的pAb；（3）成功筛选到MgPa的3个可能的模拟表位：P-S-A-A/V-X-R-F/W-E/S-L-S-P,A-K-I/L-T/Q-X-T-L-X-L和K-S-L-S-R-X-D-X-I；（4）成功制备并纯化了3个模拟表位相应的MAP——WP、AS和KH；（5）WP、AS和KH均能刺激小鼠产生较强的体液免疫和细胞免疫应答，且混合免疫组诱导的免疫应答效果比单个MAP组更好。
【图文】：

产物,琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖凝胶,测序

PCR 产物的琼脂糖凝胶电 of PCR product by agarosewas identificated by PCR as used for template and the spe was performed as described inntrol.BLAST分析养物的 DNA 测序图谱见所示，说明所测的DNA序达

生殖支原体MgPa模拟表位的筛选与鉴定及其MAP免疫效果的观察

SDS-PAGE分析rMgPa的表达
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R375

【参考文献】