【摘要】：目的： 为弥补用单克隆抗体制备D-二聚体抗体方法的不足,寻找高特异性D-二聚体抗原决定簇,本课题通过制备人源性D-二聚体粗品用来免疫小鼠,获得其抗体cDNA,为下一步D-二聚体噬菌体抗体库的构建与筛库打下基础。 方法： 采用冻融法从新鲜人血浆中提取纤维蛋白原。将人纤维蛋白原溶液与正常人新鲜血浆(提供制备交联纤维蛋白的凝血酶与ⅩⅢ因子)混合并加入咪唑缓冲液(IBS)制备得人交联纤维蛋白,再经人纤维蛋白溶解酶水解。产物通过交联葡聚糖凝胶(Sephadex) G-150凝胶过滤制备获得D-二聚体的粗品。经过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测蛋白纯度后,加入等体积完全福氏佐剂用于免疫BALB/C小鼠。再每隔一周用D-二聚体的粗品与等体积的福氏不完全佐剂混合加强免疫共3次后取脾、低温碾磨、匀浆,提取脾脏细胞总RNA,逆转录为cDNA。 结果： 1.采用冻融法从新鲜人血浆中提取的纤维蛋白原沉淀,经咪唑缓冲液溶解后加入新鲜人血浆,37℃水浴10分钟纤维蛋白原完全凝固成白色胶体状。经尿素溶解实验确定为交联纤维蛋白胶体。 2.将交联纤维蛋白胶体置于pH7.6的TBS缓冲液中,加入纤维蛋白溶解酶。经过37℃摇床水解48小时,交联纤维蛋白胶体基本完全降解为可溶性降解产物。溶液经冷干78小时后转为微黄色完全溶解液体。 3.获取的液体经非还原性SDS-PAGE,考马斯亮蓝R250染色,脱色显色后显示出几条清晰的条带。按照蛋白质Marker的分子量对照,可以认为获取液所含大部分蛋白质约为190KDa。与D-二聚体的分子量大小一致,说明酶解条件合适。 4.获取液再以每小时10m1的速度,用pH7.6的TBS缓冲液平衡,上样,凝胶过滤。每10分钟获取一次滤过液,收集完后透析,去盐,再进行SDS-PAGE,显示经β-巯基乙醇还原后出现90、80KDa的蛋白质碎片,应为D-二聚体的D碎片及β-链。 5.取得的D-二聚体粗品经微孔滤膜过滤除菌免疫小鼠,四周后提取小鼠脾脏细胞总RNA。经1%琼脂糖凝胶电泳检测,提取的总RNA三条带两条清晰可见,符合逆转录为cDNA的标准。 结论： 本课题从新鲜人血浆中提取纤维蛋白原,制备形成人交联纤维蛋白胶体,通过蛋白酶降解、凝胶过滤后分离提纯、免疫小鼠提取总RNA,逆转录形成cDNA。后期课题可运用RT-PCR技术获得抗D-二聚体抗体可变区VL、VH的基因,构建噬菌体D-二聚体抗体文库。本实验成功的分离提纯了D-二聚体粗品,为免疫小鼠提供了抗原。为成功构建全套抗D-二聚体噬菌体抗体库打下了基础。同时也为人血浆蛋白分离提纯提供了相关经验。
【学位授予单位】：湖北中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R346
【参考文献】
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本文编号：
2562901
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