低频超声联合盐酸氨溴索对表皮葡萄球菌生物被膜结构的影响及杀菌效果的研究

发布时间：2019-11-20 17:58

【摘要】：第一部分低频超声联合盐酸氨溴索对表葡葡萄球菌生物被膜杀菌效果的研究【目的】建立聚乙烯材料表面表皮葡萄球菌（Staphylococcusepidermidis）生物被膜（biofilm, BF）的体外模型，联合低频超声和盐酸氨溴索作用于成熟BF，定量分析低频超声增强盐酸氨溴索对表皮葡萄球菌BF的杀菌效果。【方法】于聚乙烯材料表面建立S. epidermidis RP62A菌株的成熟BF模型，利用快速银染法观察和鉴定BF结构。分为7组，空白对照组，单独低频超声干预组，单独盐酸氨溴索（浓度0.938、1.875mg/ml）干预组，盐酸氨溴索（浓度0.938、1.875mg/ml）+低频超声1h组，盐酸氨溴索（1.875mg/ml）+低频超声0.5h组，空白对照组只加TSB培养基，低频超声作用1h，盐酸氨溴索作用24h。分组干预后，，利用二甲氧唑黄比色法（XTT）结合BF内的活菌，结合多功能酶标仪测定吸光值，定量分析比较各不同干预组BF中细菌活力变化。【结果】 RP62A菌株成熟BF快速银染后，于光学显微镜下可见成熟BF结构，细菌成团黏附聚集，以丝状胞外多糖EPS之间相互联结。XTT法结果显示空白对照组、单独低频超声作用组OD_(450)值分别为1.895±0.146、1.932±0.077(P0.05）；单独盐酸氨溴索作用组，随着氨溴索浓度的增加，OD_(450)值呈现下降趋势，表示BF内被检出的具有活性的细菌逐渐下降，在氨溴索浓度达到1.875mg/ml时，OD_(450)值为0.472±0.056，与空白对照组（1.895±0.146）相比，P0.05；盐酸氨溴索（浓度1.875mg/ml）联合不同作用时间（0.5h和1h）低频超声组OD_(450)值分别为0.104±0.052、0.064±0.048，与单独盐酸氨溴索（浓度1.875mg/ml）作用组相比P0.05，组间相比，P0.05。【结论】单独低频超声对表皮葡萄球菌BF无清除作用，盐酸氨溴索浓度达到1.875mg/ml时，能明显杀灭成熟表皮葡萄球菌BF内的细菌，达到清除BF的效果，低频超声能明显促进盐酸氨溴索对BF的作用，且联合低频超声作用1h和0.5h组之间相比效果无明显差异。第二部分低频超声联合盐酸氨溴索对表葡葡萄球菌生物被膜结构的影响【目的】体外聚乙烯材料建立成熟表皮葡萄球菌BF，利用低频超声联合盐酸氨溴索进行干预，验证低频超声能够促进盐酸氨溴索的效果，增强其对BF结构的的破坏作用。【方法】建立聚乙烯材料表面的表皮葡萄球菌成熟BF体外模型，分为5组，空白对照组，单独低频超声作用组，单独盐酸氨溴索（浓度1.875mg/ml）作用24h组，盐酸氨溴索（浓度1.875mg/ml）作用24h+低频超声作用1h组，盐酸氨溴索（浓度1.875mg/ml）作用24h+低频超声0.5h组，SYT09/PI对BF内细菌荧光染色后，于共聚焦激光扫描显微镜(Confocal Laser Scanning Microscopy，CLSM)观察，利用图像结构分析软件(Image Structure Analyzer，ISA)对各不同干预组BF图像进行结构参数的定量分析，了解低频超声联合盐酸氨溴索对表皮葡萄球菌BF结构的影响；利用扫描电子显微镜(Scanning ElectronMicroscope，SEM)比较各不同干预组BF结构的变化。【结果】 CLSM扫描结果显示单独低频超声作用组红绿荧光分布和强度和空白对照组无明显差异，以绿色荧光（活菌）为主；单独氨溴索（浓度1.875mg／ml）作用组红色荧光信号（死菌）明显增加，绿色荧光信号（活菌）分别和强度有减少，低频超声（1h,0.5h）能明显促进氨溴索对BF的清除作用，以红色信号为主，满布视野，仅少许散在分别绿色信号。结合ISA软件定量分析各不同干预组BF结构参数的区别，单独氨溴索（浓度1.875mg／ml）作用组和空白对照组相比，BF厚度分别为（15.45±2.48）μm和（25.25±3.39）μm, P0.05；平均扩散距离(average diffusion distance，ADD)分别为2.02±0.06和2.61±0.34,P0.05;结构熵(textual entropy， TE)分别为7.19±0.19和7.88±0.09,P0.05;区域孔率(areal porosity，AP)分别为0.75±0.09和0.65±0.03，P0.05。盐酸氨溴索（浓度1.875mg／ml）联合低频超声（1h,0.5h）作用组的厚度（6.26±0.99，7.04±1.31）μm、AP分别为（0.90±0.01，0.85±0.03）、ADD分别为（1.53±0.03，1.52±0.05）、TE分别（5.68±0.07，5.82±0.52），与单独氨溴索（浓度1.875mg／ml）作用组相比，P0.05。SEM显示，空白对照组与单独氨溴索作用组BF清除效果不明显，仍可见大量BF，低频超声联合氨溴索作用的两组可见BF被破坏明显，原本复杂的立体三维结构变得层数明显减少，BF内部的相互黏附和聚集的联系被破坏，间隙增大，变得松散，大部分细菌都是以游离状态黏附于聚乙烯片表面。【结论】低频超声能够明显促进氨溴索（浓度1.875mg/ml）对表皮葡萄球菌BF的清除作用，使得BF的结构变得简单稀疏。第三部分低频超声联合盐酸氨溴索对表葡葡萄球菌生物被膜胞外多糖的作用【目的】通过建立成熟表皮葡萄球菌BF模型，验证低频超声能够促进盐酸氨溴索对BF胞外多糖的作用。【方法】建立聚乙烯材料表面表皮葡萄球菌成熟BF模型，分为5组，空白对照组，单独低频超声作用组，单独盐酸氨溴索（浓度1.875mg/ml）作用24h组，盐酸氨溴索（浓度1.875mg/ml）作用24h+低频超声作用1h组，盐酸氨溴索（浓度1.875mg/ml）作用24h+低频超声0.5h组，利用FITC-ConA对BF胞外多糖进行染色；于荧光显微镜下观察比较不同干预组荧光信号的强度和分布的区别，验证低频超声能够增强氨溴索对S epidermidis BF胞外多糖的作用。【结果】荧光染色结果显示，胞外多糖被FITC-ConA染色后呈绿色荧光，并包绕在细菌周围，呈云絮状分布，单独氨溴索（浓度1.875mg/ml）作用组较空白对照组，能有效清除包绕在BF外的胞外多糖，绿色信号减弱，云絮状物质减少，而低频超声能明显促进氨溴索对胞外多糖的作用，使得显微镜下仅观察到少许点状荧光信号。【结论】低频超声能够明显促进氨溴索（浓度1.875mg/ml）对表皮葡萄球菌BF胞外多糖的作用，使得BF结构变得疏松。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R378.11

【参考文献】