TNF-α基因siRNA真核表达载体的构建及其基因沉默效应的研究

发布时间：2019-11-24 14:21

【摘要】：研究背景肺间质纤维化(pulmonary fibrosis, PF)的发病机制目前尚不完全清楚,它是多种细胞因子及其网络共同参与的疾病,以肺组织的慢性炎症、胶原沉积、肺组织结构重塑和慢性纤维组织增生为病理特征,最终可导致呼吸功能衰竭而死亡。肺间质纤维化临床变数大,预后差,特别是特发肺间质纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis, IPF),确诊后平均存活时间不超过3-5年,目前多采用西药治疗,传统的治疗药物是糖皮质激素,或联合免疫抑制剂,但治疗的有效率低及副作用大,多数患者耐受性差,难以长期坚持使用；抗氧化剂、蛋白酶抑制剂、基因治疗及中医中药治疗等治疗方法,尚无充分的临床数据支持,仍需要进一步研究证实。目前有效治疗手段的缺乏及发病率的不断增加给国家、社会和个人造成了严重的经济和社会负担,因此,寻找肺间质纤维化的有效治疗手段迫在眉睫。近年来,随着肺间质纤维化发病机制研究的不断进行和深入,诸多关于调控、启动和促进肺间质纤维化的机制不断涌现。许多研究发现转化生长因子-β1(transforming grow factor-(31, TGF-β1)和肿瘤坏死因子-a (tumor necrosis factor-a, TNF-a)与肺间质纤维化的发生发展有重要关系。生物医学的研究表明,人类疾病的发生、发展都直接或间接与基因有关。RNA干扰技术是利用与靶基因同源的双链RNA (double strand RNA, ds RNA)诱导靶基因mRNA降解从而引起特异性转录后基因沉默。RNA干扰技术的有效载体是小干扰RNA (small interfering RNA, siRNA),因此,siRNA和RNAi的研究和应用,均具有重要的意义,有可能成为疾病基因靶向治疗的工具和手段。目的构建针对肿瘤坏死因子-α (TNF-α)基因的小干扰RNA (siRNA)真核表达载体,观察载体介导的RNA干扰技术对人肺腺癌A549细胞中TNF-α基因表达的沉默效应,探索肺间质纤维化基因靶向治疗的可能性。材料与方法 1.依据GenBank中人TNF-α (NM_000594)序列和Clontech公司的RNAi Designer软件靶序列设计原则,设计并体外合成一对针对TNF-α的特异性序列(siTNF)和一对无关序列(siCon)。退火合成DNA双链,再分别重组入pRNAT-U6.1表达载体,经过PCR扩增鉴定,并送上海生物工程有限公司进行DNA测序鉴定。 2.将构建好的重组载体(pRNAT-U6.1-siTNF、PRNAT-U6.1-siCon)及空载体(pRNAT-U6.1)用脂质体介导转染人肺腺癌A549细胞株,在荧光显微镜下观察细胞转染效果。 3.以未转染组、转染PRNAT-U6.1-siCon组和转染pRNAT-U6.1组作为对照,分别采用实时荧光定量PCR和Western blot方法检测细胞中TNF-α和TGF-β1mRNA和蛋白的表达水平。 4.数据应用SPSS17.0进行分析,统计方法为单因素方差分析和LSD检验。结果 1.确定siTNF和siCon的基因序列,两端分别加入BamH Ⅰ和Hind Ⅲ的酶切残基,并体外成功合成编码TNF-α基因的DNA寡聚核苷酸单链。 2.PCR和DNA测序鉴定证实退火片段插入pRNAT-U6.1,并且与设计序列完全一致。 3.转染人肺腺癌A549细胞后,转染PRNAT-U6.1-siTNF的A549细胞中TNF-α和TGF-β1mRNA和蛋白表达水平,与未转染、转染pRNAT-U6.1-siCon和转染pRNAT-U6.1的人肺腺癌A549细胞比较均显著降低(P0.05),而未转染细胞与转染pRNAT-U6.1细胞和转染pRNAT-U6.1-siCon细胞中TNF-α和TGF-β1mRNA和蛋白表达水平无显著性差异(P0.05)。结论成功设计并成功构建出针对TNF-α基因的siRNA真核表达载体,通过转染人肺腺癌A549细胞,能够有效沉默人肺腺癌A549细胞中TNF-α基因的表达,在细胞TNF-α基因表达沉默的同时,细胞中TGF-β1基因表达亦受到抑制。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R363

【参考文献】