巨噬细胞集落刺激因子联合转化生长因子-β体外诱导髓源性抑制细胞的表型和功能研究

发布时间：2017-03-20 01:11

  本文关键词：巨噬细胞集落刺激因子联合转化生长因子-β体外诱导髓源性抑制细胞的表型和功能研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：近年来发现髓源性抑制细胞(Myeloid derived suppressor cells,MDSCs)在固有免疫和适应性免疫中发挥着重要的作用。作为免疫抑制细胞,MDSCs用于治疗临床器官移植和自身免疫疾病已经成为研究热点。许多研究表明,多种细胞因子可以调控MDSCs的分化和功能,MDSCs也可以有效减少器官移植排斥反应和自身免疫性疾病的发病率。因此,体外建立一个从骨髓前体细胞或造血干细胞诱导产生成熟和稳定MDSCs的方法可为治疗MDSCs相关疾病和MDSCs的临床应用提供必要技术和理论基础。巨噬细胞集落刺激因子(Macrophage-colony stimulating factor,M-CSF)作为调控因子,在单核细胞、巨噬细胞和树突细胞分化过程中发挥重要作用。研究表明,M-CSF在MDSCs的产生、募集、功能中发挥重要作用,而MDSCs本身也会自分泌M-CSF,形成反馈环路。转化生长因子(Transforming growth factor beta,TGF-β)是炎症反应的一个强效调节因子,影响先天性和适应性免疫反应。已有报道指出肿瘤细胞产生的TGF-β可以参与调节不成熟髓系细胞(Immature myeloid cells,IMCs)的免疫抑制活性,并且MDSCs上膜结合TGF-β1对介导其免疫抑制功能同样起非常重要的作用。体外用M-CSF可诱导骨髓前体细胞分化为MDSCs,然而M-CSF诱导的MDSCs的稳定性和免疫抑制活性还有待探讨,并且M-CSF和TGF-β联合体外诱导髓源性抑制细胞的表型及功能研究也未见报道。因此,我们采用体外M-CSF、M-CSF联合TGF-β诱导小鼠骨髓前体细胞产生潜在免疫抑制性细胞。结果显示,流式细胞仪检测到TGF-β增强了M-CSF诱导的MDSCs的免疫抑制活性,诱导产生的MDSCs能够显著抑制自体同源T细胞增殖和IFN-γ分泌;同时还检测到M-CSF联合TGF-β诱导的MDSCs明显减弱了CD8+T细胞活化标志CD69、CD25的表达。实时荧光定量PCR分析显示TGF-β促使M-CSF诱导的MDSCs高表达MDSCs功能相关因子TGF-β、环氧酶(Cyclo-oxygen-ase-2,COX2)和精氨酸酶-1(Arginase-1,Arg-1),也增强了TGF-β+M-CSF诱导产生的MDSCs功能。在MDSCs抑制实验中补加L-精氨酸,可以恢复CD4+T细胞和CD8+T细胞的增殖能力,表明M-CSF联合TGF-β诱导的MDSCs是通过消耗底物精氨酸的机制来发挥其免疫抑制活性的。
【关键词】：髓源性抑制细胞 巨噬细胞集落刺激因子 转化生长因子-β 精氨酸酶
【学位授予单位】：河南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要4-5
• ABSTRACT5-7
• 缩略词表7-15
• 第一章 前言15-30
• 1.1 MDSCs概述15-16
• 1.2 MDSCs体外诱导16-21
• 1.2.1 鼠骨髓细胞诱导分化MDSCs16-17
• 1.2.2 鼠胚胎干细胞诱导分化MDSCs17-18
• 1.2.3 鼠其它细胞诱导分化MDSCs18
• 1.2.4 人的外周血单核细胞诱导分化MDSCs18-21
• 1.2.5 人的骨髓细胞诱导分化MDSCs21
• 1.3 扩增和激活MDSCs的内生和外生因素21-29
• 1.3.1 集落刺激因子21-22
• 1.3.2 干细胞因子22
• 1.3.3 血管内皮生长因子22-23
• 1.3.4 Flt3-Flt3L23
• 1.3.5 前列腺素E-环氧酶-2（PGE-COX2）反馈23-24
• 1.3.6 肿瘤坏死因子24
• 1.3.7 白细胞介素24-26
• 1.3.8 转化生长因子26
• 1.3.9 干扰素26-27
• 1.3.10 脂多糖27
• 1.3.11 趋化因子及其受体27
• 1.3.12 特异性抗体27-28
• 1.3.13 免疫抑制药物28-29
• 1.4 MDSCs的临床应用前景29-30
• 第二章 材料和方法30-45
• 2.1 实验材料30-34
• 2.1.1 实验动物30
• 2.1.2 其它工具30
• 2.1.3 荧光标记的表面染色抗体30
• 2.1.4 荧光标记的细胞内染色抗体30
• 2.1.5 流式染色封闭抗体30
• 2.1.6 细胞因子30-31
• 2.1.7 细胞培养相关试剂31-32
• 2.1.8 主要仪器32
• 2.1.9 引物32-34
• 2.2 溶液配制34
• 2.3 实验方法34-41
• 2.3.1 小鼠骨髓细胞的制备34-35
• 2.3.2 体外诱导免疫抑制性细胞35
• 2.3.3 脾脏单细胞悬液的制备35-36
• 2.3.4 体外抑制功能实验36-37
• 2.3.5 L-精氨酸逆转实验37
• 2.3.6 小鼠T淋巴细胞CD69、CD25表达动力学研究37-38
• 2.3.7 流式细胞仪进行抗体的滴定38
• 2.3.8 细胞表面流式染色38-39
• 2.3.9 细胞因子流式染色39
• 2.3.10 RNA提取39-40
• 2.3.11 逆转录40-41
• 2.4 实验设计41-45
• 2.4.1 M-CSF与不同浓度的TGF-β 联合诱导MDSCs对CD4+T细胞增殖的影响41-42
• 2.4.2 M-CSF与不同浓度的TGF-β 联合诱导MDSCs对CD8+T细胞增殖的影响42
• 2.4.3 M-CSF与TGF-β 联合诱导MDSCs的表型鉴定42
• 2.4.4 M-CSF与TGF-β 联合诱导MDSCs对T细胞早期活化标志CD69的影响42-43
• 2.4.5 M-CSF与TGF-β 联合诱导MDSCs对T细胞晚期活化标志CD25的影响43
• 2.4.6 M-CSF与TGF-β 联合诱导MDSCs对CD8+T细胞分泌IFN-γ 的影响43
• 2.4.7 M-CSF与TGF-β 联合诱导MDSCs免疫抑制功能相关细胞因子的检测 .. 3043
• 2.4.8 M-CSF与TGF-β 联合诱导MDSCs通过引发精氨酸耗竭机制发挥抑制功能43-45
• 第三章 结果45-56
• 3.1 M-CSF与不同浓度的TGF-β 联合诱导MDSCs对CD4+T细胞增殖的影响45-46
• 3.2 M-CSF与不同浓度的TGF-β 联合诱导MDSCs对CD8+T细胞增殖的影响46-47
• 3.3 M-CSF与TGF-β 联合诱导MDSCs的表型鉴定47-49
• 3.4 M-CSF与TGF-β 联合诱导MDSCs对T细胞早期活化标志CD69的影响49
• 3.5 M-CSF与TGF-β 联合诱导MDSCs对T细胞晚期活化标志CD25的影响49-50
• 3.6 M-CSF与TGF-β 联合诱导MDSCs对CD8+T细胞分泌IFN-γ 的影响50-52
• 3.7 M-CSF与TGF-β 联合诱导MDSCs免疫抑制功能相关细胞因子的检测52-53
• 3.8 M-CSF与TGF-β 联合诱导MDSCs通过引发精氨酸耗竭机制发挥抑制功能53-56
• 第四章 讨论56-60
• 4.1 TGF-β 对M-CSF-MDSCs免疫抑制功能的影响56-57
• 4.2 M-CSF与TGF-β 联合诱导M-MDSCs的表型鉴定57
• 4.3 M-CSF与TGF-β 联合诱导MDSCs通过引发精氨酸耗竭机制发挥抑制功能57-58
• 4.4 M-CSF与TGF-β 联合诱导产生MDSCs的临床应用前景58-60
• 第五章 结论60-61
• 参考文献61-73
• 致谢73-74
• 攻读学位期间发表的学术论文目录74-75

【共引文献】

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本文编号：256919