肠道病毒71型抗血清的制备及初步应用研究

发布时间：2020-01-23 09:00

【摘要】：肠道病毒71型(EV71)属于微小核糖核酸病毒科(Picornavirdae),肠道病毒属(Enterovirus, EV)。EV71的感染可以导致手足口病(HFMD),一般症状轻微,仅表现为皮疹或疱疹性咽峡炎,预后良好。重症病例病情进展迅速,可表现为中枢神经系统受累和急性呼吸循环衰竭。人是EV71的唯一自然宿主,对EV71普遍易感,但以婴幼儿和5岁以下儿童感染为主。目前国内外实验室诊断EV71感染的方法主要有病毒分离、酶联免疫吸附试验(ELISA)、中和试验、免疫组化检测、反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、核苷酸序列测定、基因芯片技术等,每种方法各有优缺点,而目前基层实验室尚缺乏快速和准确的诊断方法。本次研究以不同免疫方案制备EV71抗血清,筛选最佳免疫方案,同时利用制备的EV71高价抗血清建立间接ELISA试验方法,检测本实验室采集的咽拭子标本,对基层实验室开展EV71早期诊断具有重要意义。目的 1.比较不同免疫方案制备EV71抗血清的免疫效果,选择最优免疫方案,为下一步制备EV71单克隆抗体(McAb)奠定免疫基础。 2.用制备的EV71抗血清建立间接ELISA试验法,检测HFMD患儿咽拭子标本中的EV71,评价其检出效果。方法 1.用EV71的SDLY107株感染RD细胞并收获病毒,初步纯化后用50%终点法测定病毒滴度,取一部分病毒液以紫外线灯(40w)照射对病毒进行灭活。 2.将BALB/c鼠随机分为5组,每组9只。其中1-4组为实验组,第5组为对照组。1、2组以灭活病毒免疫,3、4组以活病毒免疫,1、3组的免疫间隔时间为2周,2、4组为3周；第5组用磷酸盐缓冲液(PBS)免疫,免疫间隔2周,每组各免疫4次。 3.末次免疫后摘眼球取血,用间接ELISA试验法和中和试验(固定病毒-稀释抗血清)法分别检测各组小鼠血清抗体滴度。 4.用RD细胞分离2010年山东省临沂市HFMD暴发期间采集的44份患儿咽拭子标本中的病毒,RT-PCR法扩增病毒分离液中的EV71并测序鉴定,作为EV71检出的“金标准”。 5.以咽拭子标本液作为包被抗原,制备的EV71抗血清作为一抗,辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠IgG作为二抗,建立间接ELISA试验法检测标本中的EV71,与RT-PCR的检测结果进行比较。结果 1.50%终点法测得EV71的病毒滴度为2×10-3.25/0.1ml,紫外线照射法完全灭活EV71的最短时间为30min。 2.ELISA结果显示,4个实验组均产生阳性抗体(A/A02.1),对照组抗体阴性(A/A02.1),1-5组吸光度(A)值依次为1.0817±0.2897、1.0296±0.3719、1.0748±0.3749、1.4929±0.2159、0.1687±0.0218。对其进行单因素方差分析,F=23.449,P0.05,差别有统计学意义,LSD-t检验结果,第4组与1、2、3组差别均有统计学意义(P0.05),而其余组差别无统计学意义(P0.05)。 3.第4组(活病毒间隔3周免疫组)ELISA法测得抗体滴度为1.024×105,中和试验法测得抗血清中和效价为1：64。 4.咽拭子标本接种RD细胞并盲传二代后,100%出现细胞病变,经RT-PCR扩增并测序鉴定,均为EV71。 5.以EV71抗血清作为一抗,ELISA法检测咽拭子标本,阳性率为100%,与RT-PCR检测结果相比,灵敏度、特异度、符合率均为100%。结论 1.不同免疫方案制备的EV71抗血清,抗体滴度不完全相同,其中活病毒间隔3周免疫组抗体滴度最高,可作为制得高滴度EV71抗血清的理想选择,并为制备EV71McAb奠定免疫基础。 2.以EV71建立的间接ELISA法可早期、快速、准确检测患儿咽拭子标本中的EV71,与RT-PCR扩增病毒分离液的结果相比,灵敏度、特异度、符合率均为100%,可在基层实验室推广使用。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R373

【参考文献】