三种重金属单抗的制备与抗体基因序列分析及其免疫检测方法的建立

发布时间：2020-01-27 10:34

【摘要】：重金属污染事件层出不穷,愈演愈烈,畜禽产品重金属残留不同程度超标,威胁人畜健康。快速、廉价地监测生境中重金属是减小其对人类及动物危害的先决条件。建立更快速、更经济的免疫分析法检测重金属是生产及经济发展的需要。本研究旨在建立能够稳定分泌高亲和力和特异性抗重金属汞、铜和锌的单克隆抗体的杂交瘤细胞株,克隆抗重金属汞、铜和锌单克隆抗体的重链和轻链可变区基因,建立其免疫分析方法并得到初步应用。本研究将重金属(汞、铜和锌)通过双功能螯合剂与血蓝蛋白偶联制备了免疫抗原,与牛血清白蛋白偶联制备了检测抗原。通过BCA法、紫外分光光度法、SDS-PAGE电泳和石墨炉原子吸收光谱法鉴定重金属汞、铜和锌螯合物人工抗原。用合成的免疫抗原免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术建立能稳定分泌抗重金属汞、铜和锌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分析杂交瘤细胞的染色体,鉴定。通过抗体亚型鉴定试剂盒鉴定单克隆抗体的类和亚类,通过体内诱导法大量制备并纯化抗体,通过间接酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测抗体效价、亲和力和细胞株分泌抗体的稳定性,间接竞争ELISA(IC-ELISA)法测定抗体的特异性。通过提取杂交瘤总RNA、RT-PCR,扩增抗体可变区基因,克隆测序分析该基因。采用矩阵实验确定抗原抗体的最佳组合,通过对封闭物、pH值、离子强度等影响因子的研究,确定IC-ELISA的最佳工作参数。研究结果表明:成功制备了汞、铜和锌的免疫抗原和检测抗原,并建立了能稳定分泌特异性抗重金属汞、铜和锌单克隆抗体的杂交瘤细胞株分别为3G4-G5、9D11-F3和Z1A5,抗体均为IgM亚类,轻链为kappa型,亲和力达10~9L/mol～10~(10)L/mol,半数抑制浓度(IC50)分别为1.15μM、0.257μg/mL和0.628μg/mL,与其他金属的交叉反应低。从杂交瘤细胞3G4-G5、9D11-F3和Z1A5中克隆得到了抗重金属汞、铜和锌单克隆抗体的重链和轻链可变区基因。在IC-ELISA最佳工作参数确定的情况下,建立定量测定金属离子汞、铜和锌的方法,检测范围(IC20～IC80)分别为0.15μM～9.0μM,0.055μg/mL～1.198μg/mL和0.062μg/mL～6.341μg/mL,最低检测限分别为3.94×10~(-5)mM,0.0227μg/mL和0.015μg/mL。水样中的汞、铜和锌添加回收率为分别为88.9%～107.3%,87.4%～106.8%和88.6%～109.4%。本研究成功制备了重金属汞、铜和锌抗原,建立了3株能稳定分泌高亲和力、高特异性抗重金属汞、铜和锌单克隆抗体的杂交瘤细胞,且克隆得到了抗重金属汞、铜和锌单克隆抗体的重链和轻链可变区基因,为下一步通过基因工程改造抗体奠定了基础。建立重金属汞、铜和锌残留IC-ELISA检测法,并能有效地用于实验室水样的重金属汞、铜和锌残留检测,为重金属汞、铜和锌残留检测试剂盒的研发奠定了基础,为农畜产品及环境安全检测提供了重要的工具,对提高风险评估工作的效率和质量,保障食品安全有重要现实意义。
【图文】：

水质类别,七大,水系,比例

金属对土壤的污染工业废弃物排放和农业化肥的大量使用，土壤重金属污染已经[12]。农业生产土壤的重金属污染可通过食物链直接进入动物体土壤与大气、水、岩石等是密切不可分开，大气沉降、水污染壤重金属污染。农业土壤重金属污染物主要为镉、铅、铬、汞图 1-1 2009 年七大水系水质类别比例[10]Fig.1-1 The proportion of water categories of seven water systems in 2009

线路图,螯合物,重金属,抗原

免疫抗原 Hg-ITCBE-KLH 的制备：称取 10mg ITCBE 溶于 1mL DMSO 溶液，取150μL 转入反应器，再加入浓度为 500mg/mL 的汞溶液 2.2μL，室温反应 30min，然后同时加入0.4mL pH9.73的HEPES缓冲液和浓度为5.9g/L的KLH 1.695mL，调pH至9.0，室温下搅拌反应 12h。检测抗原 Hg-ITCBE-BSA 的制备：称取 10 mg ITCBE 溶于 1mL DMSO 溶液，取180μL 转入反应器，，再加入浓度为 500mg/mL 的汞溶液 2.6μL，室温下反应 30min 后同时加入 0.4mL pH9.73 的 HEPES 缓冲液和 20mg BSA，调节 pH 至 9.0，室温下搅拌反应12h。检测抗原 ITCBE-BSA 的制备：合成方法同上,用超纯水代替金属离子即可。抗原的分离纯化：CentriconYM-30 超滤离心管预先用 0.1mol/L 的乙二胺四乙酸（EDTA）溶液浸泡过夜后，再用 pH 为 9.73 的 HEPES 缓冲液冲洗。偶联反应后，用超滤管 Centricon YM-30 对蛋白复合物进行分离纯化，去除没有参与反应的金属、螯合剂和金属-螯合剂复合物，分离纯化时先用 pH 为 9.73 的 HEPES 缓冲液洗涤超滤管 1 次，图 2-1 重金属汞抗原螯合物的合成线路Fig.2-1 The synthetic route to the mecury antigen conjugates
【学位授予单位】：内蒙古农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R392

【参考文献】