PDCD5蛋白抗体制备及其定量检测方法的研究

发布时间：2020-02-06 02:28

【摘要】：程序化细胞死亡因子5(programmed cell death5，PDCD5)是北京大学人类疾病基因研究中心从白血病细胞株TF-1细胞中克隆得到的一个基因。该基因种属之间进化高度保守，在50多种组织中都有表达，其表达在肿瘤组织中下调，免疫缺陷病上调，和疾病的发生发展紧密相连。因此，PDCD5蛋白的定量检测方法的建立和研究，对PDCD5蛋白的研究和疾病的临床诊断等方面具有重要的现实意义。本研究采用基因工程重组PDCD5蛋白作为免疫原，免疫6～8周BALB/C小鼠，通过细胞融合、有限稀释法筛选获得3株能够稳定分泌抗PDCD5蛋白的杂交瘤细胞株，分别命名为PDCD5-A2、PDCD5-D1、PDCD5-H3，制备腹水并纯化。经鉴定，此三株单克隆抗体的免疫球蛋白均为IgG1,效价达到105以上，具有良好的特异性。用重组PDCD5蛋白免疫新西兰大白兔，制备兔抗PDCD5白蛋多克隆抗体，经琼脂扩散实验检测效价达到1：32。将制备的多克隆抗体经硫酸铵初步纯化后再经层析法对其进一步纯化，经鉴定获得纯度较高的抗体。然后采用高碘酸钠法对单抗和多抗分别进行辣根过氧化物酶（HRP）标记，经双扩散检测标记后的抗体和酶均有活性。用纯化多克隆抗体作为包被抗体，标记的单克隆抗体做为酶标抗体，具有活性。初步建立检测PDCD5蛋白的定量双抗体夹心ELISA检测方法，该检测方法对高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、脂联素、甲胎蛋白、血红蛋白等无交叉反应，具有良好的特异性。用本实验建立的ELISA检测方法检测正常人血清55份、类风湿性关节标本21份和各种癌症标本81份，统计学处理用t检验，结果显示癌症样本血清中PDCD5水平（17.52±4.32ng/ml）显著低于正常人血清（20.43±5.32ng/ml）（P0.05）；而乳腺癌（17.24±4.30ng/ml）、骨髓瘤（18.04±2.11ng/ml）、食管癌（17.54±1.27ng/ml）和肺癌（18.13±4.26ng/ml）各种癌症患者血清中PDCD5蛋白含量无显著性差异（P0.05）；类风湿性关节炎样本血清中PDCD5含量（35.94±17.12ng/ml）显著高于正常人血清（P0.01）具有统计学意义。本研究以重组蛋白免疫BALB/C鼠和新西兰大白兔制备单克隆抗体和多克隆抗体，初步建立了PDCD5蛋白的定量双抗体夹心ELISA检测方法，，并利用本方法探讨血清PDCD5含量变化与疾病的相关性，为疾病的辅助诊断提供一种新的方法。
【图文】：

氨基酸序列,基因,上游序列,启动子活性

图1 PDCD5的基因及cDNA结构利用FIRSTEF软件，根据contig NT_011109.15将PDCD5及其上游的1200bp进行启动子预测，未发现典型启动子区域。但是CpG岛分析提示，PDCD5上游序列富含G/C，并具有典型的CpG岛，可能具有启动子活性。Xu等通过荧光素报告酶系统的研究，证明PDCD5上游序列具有极强的启动子活性[11]。1.1.2 PDCD5蛋白的分子特性人PDCD5 蛋白全长含125 个氨基酸，分子量为14285 道尔顿，等电点5.78。氨基酸序列中无半胱氨酸和色氨酸，提示其不含有二硫键。PDCD5也无明显的疏水区、跨膜区和信号肽，表明其不是分泌蛋白或膜蛋白。表达谱分析证明人PDCD5表达较广，胚胎组织表达量低于成年组织，肿瘤细胞表达量低于正常组织。细胞中PDCD5以中或低水平定位在胞质和胞核。用NMR方法对PDCD5蛋白的二级结构进行分析，结果显示PDCD5蛋白分子包含6个α螺旋。其中Lys33-Thr103区域折叠为球蛋白，包含4个α螺旋，螺旋之间

电泳图,单克隆抗体,纯度

4、5、6：硫酸铵沉淀纯化后 PDCD5-A2、PDCD5-H3、PDCD5-H3；7、8、9：腹水（稀释四倍后）PDCD5-A2、PDCD5-H3、PDCD5-H3图.3-1 单克隆抗体纯度结果由上图可知通过两步纯化后电泳图几乎无杂带，抗体纯度可达 96%。根据浓度计算公式：蛋白浓度（mg/mL）=OD280nm×1.45- OD260nm×0.74 ，测得三株单抗的浓度分别为 0.964 mg/mL（PDCD5-A7）、0.781 mg/mL（PDCD5-D1）、1.2 mg/mL（PDCD5-H3）。3.9 兔血清效价检测第三次免疫后，从新西兰大白兔耳静脉取血，离心取上清，采用双向琼脂扩散实验检测效价结果如图。
【学位授予单位】：河南工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R392

【相似文献】