流感病毒NS1蛋白对细胞生长调控及与Nucleolin相互作用的研究

发布时间：2020-02-07 15:08

【摘要】：甲型流感病毒属于正黏病毒科,基因组由8股负链的RNA组成,其中第8节段RNA编码非结构蛋白NS1,该蛋白在受感染的宿主细胞中合成,在调控病毒致病性和毒力,影响宿主细胞免疫反应及凋亡等多个方面具有重要作用。 本研究利用生物信息学分析软件对2009年甲型流感NS1(2009NS1)和1918年流感NS1(1918NS1)蛋白氨基酸序列进行分析,2009NS1蛋白与1918NS1蛋白相比较,在C端缺失了RKMARTIKSE 10个氨基酸,即PL结构域。其余位点共发生了32个氨基酸变异。 为进一步研究甲型流感病毒NS1蛋白对真核细胞的作用,本研究通过RT-PCR技术克隆了2009NS1基因、全基因合成获得了1918NS1,应用pNTAP-B、pCMV-HA、pEGFP-C1载体,构建了TAPNS12009、HANS12009、HANS11918等5种NS1真核表达载体。利用脂质体法将重组载体转染A549细胞,应用Western Blot方法,检测NS1蛋白表达量,通过对转染试剂体积、质粒质量等优化,获得高效转染A549细胞条件为:脂质体2000 9μL,质粒2μg,瞬转NS1 96h后,NS1蛋白的表达量达最高值。 应用2009NS1、1918NS1真核表达载体瞬时转染A549细胞,利用显微镜观察表达NS1蛋白的A549细胞形态,细胞出现皱缩,体积变小,变圆,细胞核固缩,染色质边缘化等细胞凋亡现象。应用AnnexinV染色法检测细胞凋亡,实验组阳性细胞数均高于空白和阴性对照组,且A549/1918NS1的阳性细胞数高于A549/2009 NS1;利用流式细胞仪检测细胞周期,发现实验组细胞周期发生G2/M期阻滞,且A549/1918NS1 G2/M期与Apoptotic期的细胞比例均大于A549/2009NS1;利用Western Blot方法检测NS1蛋白对细胞周期关键蛋白的影响,发现NS1蛋白可上调p53、p21蛋白的表达,同时能促进p53蛋白15位Ser的磷酸化,且1918NS1蛋白对这些蛋白的作用大于2009NS1蛋白。结合以上结果推测NS1蛋白能够通过上调p53、p21蛋白表达、促进p53磷酸化,使细胞周期阻滞于G2/M期,同时诱导宿主细胞凋亡,1918NS1作用强于2009NS1,可能与2009NS1缺失PL结构域有关。 应用TAP亲和纯化技术获得TAPNS1蛋白与其相互作用蛋白的复合物,通过Western blot检测NS1相互作用蛋白Nucleolin,GST Pull Down技术进一步验证了NS1蛋白与Nucleolin具有相互作用,且相互作用位点位于NS1 1-82aa。这为进一步研究NS1蛋白调控真核细胞细胞周期及诱导其凋亡的机制奠定了基础。
【图文】：

图 1-1. 流感病毒 NS1 蛋白结构图Fig.1-1 The structure of Influenza NS1 proteinStructure of Swine Flu Virus NS1 Effector Domain from HA/California/07/2009—3M5R）

图 2-2. 2009NS1 基因 RT-PCR 扩增g.2-2. The amplification of 2009NS1 gene by RNAMarker；1，，2009NS1 RT-PCR 扩增
【学位授予单位】：天津大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R363

【参考文献】

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本文编号：2577220