【摘要】：目前大量文献报导证实了nNOS来源的NO是正常成年脑组织中神经发生的负调控因子，我们通过体外实验证明神经元中nNOS产生的NO负调节神经干细胞的增殖与分化，这与整体动物实验结果一致。另一方面，我们观察到抑制干细胞自身nNOS的活性明显降低其增殖速率以及分化形成神经元的比例,同时诱导了细胞凋亡，这说明干细胞的nNOS有利于神经发生。但是神经干细胞核内的nNOS是否是干细胞分化为神经元的必需分子，以及这是否与神经元的存活相关，有待于我们进一步的研究。 神经干细胞分化与细胞内的基因转录密切相关，我们知道组蛋白脱乙酰化酶（HDAC）降低组蛋白乙酰化程度，使得染色体结构紧缩，结果抑制基因表达。HDAC的亚型中HDAC1和HDAC2与神经干细胞分化的关系最为紧密，但是在我们所关注的神经元中HDAC1的表达几乎不能被检测到，所以我们重点观察HDAC2对神经元分化的影响，以及抑制干细胞中nNOS是否是通过HDAC2调节神经发生的。 因此，我们在研究中主要探讨下面两个问题：（1）神经干细胞的nNOS是否是神经元分化的必需分子；（2）神经干细胞内的nNOS是否是通过HDAC2调节自身增殖以及神经元分化的。 第一章神经干细胞nNOS是神经元分化的必需分子 为了研究神经干细胞内的nNOS在其分化过程中是否扮演了非常重要的角色，我们进行了如下的体外实验。首先，我们体外培养野生型（nNOS+/+）和nNOS基因敲除型（nNOS-/-）的胚胎小鼠神经干细胞，让其贴壁分化四天。从免疫荧光的结果中我们观察到，虽然nNOS-/-后GFAP+星型胶质细胞比例与nNOS+/+相比没有差异，但是β-Ⅲ-Tubulin+神经元的分化比例却明显下降（nNOS+/+20.39±1.20%，nNOS-/-11.21±2.69%）。此实验结果证明敲除神经干细胞nNOS抑制神经元分化。 我们之前的研究结果证明了神经干细胞内的nNOS-/-后其自身的增殖能力显著减弱，而神经元分化比例的下降可能是三个方面的因素：减少神经干细胞或前体细胞的增殖、诱导神经元的死亡以及抑制神经干细胞向神经元分化的趋势。为了观察敲除nNOS后神经元分化比例的下降是其中某个因素的作用还是几个因素的共同结果，我们采用nNOS特异性抑制剂L-VNIO(100μM)在分化后两天给药（即分化的第三天和第四天）。这种情况下，神经前体细胞的增殖没有受到L-VNIO的明显抑制，但我们可以观察到在β-Ⅲ-Tubulin+神经元比例下降的同时(Control20.83±0.31%，L-VNIO6.23±0.40%），L-VNIO也使得碘化丙啶阳性（PI+）的死亡细胞数显著增多（Control3.48±0.07%，L-VNIO4.91±0.15%）。我们假设死亡的细胞全是神经元，即L-VNIO显著诱导了神经元的凋亡，如果弥补上凋亡在神经元分化比例方面的负面效应后，L-VNIO仍然降低神经干细胞分化形成神经元的速率，那么我们就可以肯定L-VNIO抑制了神经干细胞向神经元分化的趋势，即抑制神经干细胞的nNOS活性阻碍了神经元的分化命运。我们采用了如下的公式：n_(j+1)=n_j+β_j(N_j-n_j)-δ_jnn_j；PI+_j+1-PI+_j=δ_jN_j，实验结果发现，当δ_jnn_j=δ_jN_j时，即假设PI+凋亡细胞都是神经元，此时L-VNIO组的β_j(_j=4)值仍然显著小于生理对照组（Control0.426±0.05，L-VNIO0.136±0.06）。以上结果说明，抑制nNOS负调控神经元的分化命运。 为了通过不同的干预手段来研究神经干细胞内的nNOS对神经元分化的作用，我们在神经干细胞贴壁分化第一天给予50mM的KCl24小时，以增加神经前体细胞中nNOS的表达水平。我们发现，KCl使得神经元分化比例升高（Control14.07±1.03%，KCl24.95±2.07%），而且敲除nNOS后KCl的这种效应被取消，说明KCl通过增加nNOS的表达促进神经干细胞向神经元分化。同时我们还观察到KCl会诱导细胞的凋亡，从而引起总细胞数的下降，为了排除KCl升高神经元分化比例不是总细胞数下降导致的表面现象，我们将分化的神经元的数目进行统计，结果显示KCl给药组的神经元数也明显多于对照组（Control15.65±1.08，KCl23.87±2.70）。上述实验表明，上调nNOS表达水平有利于神经元的分化。 第二章nNOS通过HDAC2调控神经干细胞增殖和神经元分化 之前，我们证实了神经干细胞内的nNOS是维持其自身增殖和神经元分化的必需分子，并且据文献推测组蛋白脱乙酰化酶2（HDAC2）很可能是这条通路中的关键分子。为了研究这一假说，我们首先观察nNOS是否能调节HDAC2。我们体外培养胚胎神经干细胞，在神经球状态下给予100μM的nNOS特异性抑制剂L-VNIO，24h后提蛋白，Western Blot结果显示，L-VNIO显著抑制HDAC2的表达。为了进一步证实nNOS对神经干细胞中HDAC2的调节作用，我们继而采用nNOS基因敲除鼠培养细胞，结果发现，与野生型比较，nNOS敲除后HDAC2的表达下降，这与使用nNOS抑制剂L-VNIO的结果一致。我们给予神经球100μM L-VNIO，作用3h后提蛋白并进行免疫沉淀分离出HDAC2，再利用HDAC荧光测定试剂盒检测其活性，结果表明L-VNIO不影响神经干细胞中HDAC2的活性。另外，为了观察在神经干细胞分化阶段nNOS如何影响HDAC2，我们在神经干细胞贴壁分化第二天给100μM的L-VNIO，48h后提蛋白，Western Blot测定结果表明，L-VNIO不显著影响分化过程中HDAC2的表达，而在分化第四天给予L-VNIO3h却可以增强HDAC2活性。以上的实验结果表明，抑制神经干细胞nNOS下调HDAC2的表达不影响其活性，而抑制分化细胞nNOS不影响HDAC2的表达却显著增强其活性。 既然nNOS可以影响HDAC2，那么nNOS是否是通过HDAC2调节干细胞增殖和神经元分化的呢？针对这个问题，我们首先观察HDAC2在干细胞增殖和分化过程中到底扮演了什么角色。一方面，我们使用HDAC2shRNA慢病毒颗粒转染神经干细胞单细胞悬液，四天后将神经球吹散计数。结果发现，与转染Control shRNA慢病毒颗粒组比较，HDAC2被干扰后干细胞的增殖能力受到抑制。另外，我们将转染过HDAC2shRNA慢病毒的干细胞的单细胞悬液以2×104个/cm~2的密度接种到PORN/LAM包被的玻片上，让其贴壁生长，24h后掺入10μM的BrdU2h，BrdU免疫荧光结果同样证实了干扰干细胞中HDAC2的表达会抑制其自身的增殖（LV-Control shRNA41.67±1.44%, LV-HDAC2shRNA33.27±1.74%）。我们让转染过HDAC2shRNA慢病毒颗粒的干细胞贴壁分化4天后，进行β-Ⅲ-Tubulin免疫荧光实验，，结果发现与对照组的6.94±0.94%相比，HDAC2干扰后的神经元比例上升到13.12±1.00%，说明HDAC2负调节神经元分化。另一方面，我们使用HDAC2过表达的腺相关病毒颗粒转染神经干细胞，细胞计数和免疫荧光结果显示过表达HDAC2对干细胞增殖没有显著影响，却明显抑制神经元的分化比例。上述实验说明HDAC2是维持神经干细胞增殖的必需分子，是神经干细胞向神经元分化的负调控因子。 最后，我们观察胚胎和成年神经干细胞内的nNOS是否是通过HDAC2调节自身的增殖以及神经元分化的。我们首先通过细胞计数的方法观察HDAC2过表达是否能逆转L-VNIO引起的神经干细胞增殖减慢的效应。其次，我们通过免疫荧光方法观察干扰掉HDAC2是否能逆转L-VNIO抑制神经元分化的作用。实验结果表明，抑制nNOS分别通过下调神经球状态下HDAC2的表达和增强分化过程中HDAC2的活性减少神经干细胞增殖和神经元分化。
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R329
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