新型功能分子BST2单克隆抗体的制备、鉴定和初步应用

发布时间：2020-02-29 22:07

【摘要】：BST2(Bone Marrow Stromal Antigen2)骨髓基质细胞抗原2，又被称为CD317，HM1.24或者tetherin，是天然免疫中针对囊膜病毒的应答因子。BST2的cDNA是从由风湿性关节炎衍生出的一种滑液细胞系中克隆出来，当时被认为BST2蛋白参与了前体B细胞生长。BST2能够将vpu蛋白缺失的HIV-1病毒粒子拴在细胞膜上，阻止病毒的释放，BST2因此被命名为“tetherin”。BST2对囊膜病毒的出膜具有广谱的抑制作用，是抗击囊膜病毒疾病的一种天生固有的免疫方式。BST2有如此广谱的抑制病毒作用的原因之一，在于这些病毒都具有源于宿主细胞双层脂膜的囊膜结构，BST2能够通过在病毒出细胞膜时直接拴住病毒而起到抑制作用，而近期研究发现，BST2还具有促进某些病毒进入细胞的功能。随着对BST2功能和结构的不断了解，必将在相关药物开发及疾病控制中发挥更大的作用。本实验利用分子生物学手段，通过软件预测，根据已知的BST2基因序列设计出特异性引物，通过PCR技术扩增得到BST2的基因片段，经过琼脂糖电泳及测序证明我们正确扩增到BST2339bp的基因片段。设计了扩增质粒和表达质粒，将BST2基因片段克隆至质粒中，质粒鉴定正确后，转化至BL21a大肠杆菌表达系统，可溶性表达了BST2的蛋白。镍离子亲和层与凝胶层析纯化蛋白后，测定了蛋白浓度，使抗原达到免疫实验要求。三次免疫Balb/C小鼠，加强免疫后采小鼠脾细胞与复苏的SP2/0细胞株进行融合。经过三个克隆阶段，成功制备了2株鼠源单克隆抗体(McAb)，命名为10-1和11-1。经测定效价均为107，Westernblot方法及表面等离子共振技术对其特异性及亲和力等特性进行了检测，结果显示这两株单抗具有较好的特异性和较高的亲和力。采集并分离了HIV感染病人及正常人的外周血，并分离得到了外周血单核细胞(PBMCs)。通过流式细胞技术，利用单克隆抗体及绿色荧光FITC标记的二抗共染了外周血单核细胞，比较了BST2蛋白在HIV感染病人与正常人外周血单核细胞中的表达差异。初步结果显示，感染后人外周血单核细胞表面BST2表达量比正常人血液中的低。 BST2蛋白表达、单克隆抗体制备及检测方法的初步应用，，为进一步揭示BST2蛋白作用机制、功能及抗病毒药物开发提供详实数据及方法。
【图文】：

人造BST2图示

抑制最简单的模型是 BST2 直接拴住完全成熟的已经芽出的病毒（图 ]。这种模型为免疫电镜得出的数据支持，在 HIV 芽出的位点有 BS并且还有 BST2 被完全包进了病毒粒子[29]。BST2 全长 181 个氨基酸, 是一个大约 30-36KD 的小分子蛋白（糖基化，大小有所差异），属于二类跨膜蛋白。BST2 单体由一个 N 端的跨膜段胞内区、胞外区、C 端的 GPI 锚定位点组成（图 1-1）[5]；目前为止2 拓扑结构相似的只有 PrP[6]。成熟的 BST2 在其多肽链的第 65 个和第酰胺处被糖基化，并能通过二硫键形成同源二聚体。该蛋白被定位在细一些具有膜结构的胞内细胞器上，如 TGN 以及循环胞内体[5,7-9]。BST2重要的特点。虽然它的胞内区很短，但是却意义重大。该胞内区含有基序，可以与网络蛋白受体 AP-2 和 AP1 结合，直接进入胞吞作ear endosomes 胞内区也间接与细胞的皮层肌动蛋白网络作用，但是这种与 BST2 作为一个抑制因子是否有关系仍旧未知[10]。灵长类动物的 BS的赖氨酸残基，能被 KSHV 的 K5 蛋白识别并泛素化[11]。
【学位授予单位】：河南科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R392.1

【参考文献】