计算机辅助构建组织工程肝脏仿生三维血管网络的研究

发布时间：2020-03-04 08:40

【摘要】：第一部分骨髓源性间充质干细胞的分离、培养、鉴定和分化目的：探讨小鼠骨髓源性间充干细胞(mesenchymal stem cells MSCs)体外培养、鉴定、分化的方法,研究间充质干细胞在体外环境下向内皮细胞分化的效率和功能变化。方法：分离小鼠股骨、胫骨,肝素抗凝,冲出骨髓,以Percoll密度梯度离心法与贴壁培养法联合分离、培养、纯化骨髓间充质干细胞。我们通过MTT法制备骨髓干细胞体外生长曲线。以CD29、CD90、CD105、CD34、CD45单克隆抗体通过流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表面标志。通过以地塞米松、胰岛素等诱导P3代MSC向脂肪细胞分化,诱导后,以油红染色鉴定分化的脂肪细胞。以VEGF诱导MSC向内皮细胞分化,以CD34、KDR等内皮细胞表面标志鉴定诱导后的内皮细胞。结果：(1)密度梯度离心结合贴壁培养法分离细胞,细胞接种12h后,可见有圆形或椭圆形细胞贴壁,72h后出现散在的纺锤状贴壁细胞,细胞培养1O天后,出现致密的贴壁细胞层,此时细胞的两极开始有规律地排列成束状。(2)CD29、CD90、CD105流式检测MSC表面标志,阳性率均在90%以上。CD34、CD45则都低于8%。(3)骨髓干细胞P3向脂肪细胞诱导后,加入油红O染液显示细胞内有橙红色脂肪滴呈现。(4)骨髓干细胞经血管内皮因子诱导诱导一周时,有散在的鹅卵石样细胞出现。诱导两周后,形成致密的贴壁细胞层,大部分细胞呈圆形或卵形形,细胞呈“铺路石”样排列。CD34、KDR阳性率分别为89.24±6.37%,85.19±4.52%。FITC-UEA-1, DiI-acLDL双染诱导后内皮细胞阳性率为89.83±4.49%。同时,诱导后的内皮细胞在体外保持良好的成管能力。结论：密度梯度离心法结合贴壁培养法可以在体外分离、培养出高纯度骨髓间充质干细胞。骨髓间充质干细胞在体外经过传代培养后,依旧具有多向分化潜能。目的：以己内酯和碳酸亚乙酯为原料合成可降解高分子聚合物聚己内酯-碳酸亚乙酯Poly(EC-CL),通过静电纺技术制备纳米Poly (EC-CL)电纺膜。方法：以甲苯为溶剂,通过稀土配合物Nd(DBMP)3催化碳酸亚乙酯和CL开环共聚合。NMR检测聚合物化学结构,FTIR傅里叶全反射红外光谱分析聚合物中特征集团的变化。以六氟异丙醇为溶剂,EC/CL共聚物比例为1：9,1：6,1：4的Poly(EC-CL)共聚物为原料,分别制备不同浓度的电纺膜,通过扫描电镜(SEM)观察纺丝膜的纤维形貌。力学性能测试检测各组电纺膜的拉伸强度、杨氏模量和断裂伸长率。结果：从共聚物Poly (EC-CL)红外图谱证实聚合物为酯类聚合物,通过核磁共振图谱没有发生EC单体的均聚合和脱C02副反应发生,所得共聚物为无规共聚物。在poly (EC-CL)浓度为5%时,当EC/CL从1：9上升到1：4时,纤维直径从212±52nm上升到522±68nm,poly(EC-CL)浓度为10%时,当EC/CL从1：9上升到1：4时,纤维直径从535±79nm上升到956±142nm,poly (EC-CL)浓度为15%时,EC/CL为1：9时,电纺膜纤维直径为867±93nm,而EC/CL浓度为1：6和1：4时,不能形成有效电纺纺丝。力学性能测试发现随着EC含量的增高,聚合物拉伸强度、屈服强度和杨氏模量逐渐下降,而断裂伸长率随EC含量增高而增大。结论：Poly (EC-CL)的浓度影响电纺纤维膜的形态,Poly (EC-CL)是一种力学性能可调控的新型可降解高分子材料。目的：以合成高分子材料Poly(EC-CL)和血管内皮生长因子VEGF为原料,利用静电纺丝技术构建具有良好细胞相容性和机械性能的纳米支架。方法：将VEGF与Poly (EC-CL)混合,配置成质量比为Ong/g、10ng/g、100ng/g、1ug/g的溶液,电压15kV,流速2m1/h电纺纳米纤维支架。扫描电镜检测电纺膜纳米形态,细胞增殖试验、Live/Dead细胞试剂盒检测试验、细胞黏附试验、LDH释放试验、间接接触溶血试验、皮下植入试验检测电纺膜细胞相容性和血液相容性。Poly (EC-CL)电纺膜诱导分化MSCs试验检测电纺膜内VEGF体外分化MSC的能力。结果：混合VEGF的poly (EC-CL)与纯poly (EC-CL)聚合物膜片相比,纤维形态没有分别,纳米纤维直径在440±55nm,我们增加VEGF含量,纤维直径没有明显变化(p0.05)。细胞增殖试验、Live/Dead细胞试剂盒检测试验、细胞黏附试验证实Poly(EC-CL)/VEGF电纺膜具有良好的细胞性容性,VEGF/poly (EC-CD (100ng/g;1μg/g)组上细胞明显高于poly (EC-CL)和VEGF/poly (EC-CL)(10ng/g)(P0.05)。间接接触溶血试验各组溶血率均6%,皮下植入试验膜片四周炎症反应轻微。当VEGF含量100ng/g时,可以有效诱导MSC向内皮细胞分化。结论：Poly (EC-CL)/VEGF共聚物具有良好的细胞相容性、组织相容性和血液相容性,能够作为生物医用植入材料。当VEGF含量100ng/g时,可以有效诱导MSC向内皮细胞分化。目的：完成仿生肝脏三维空间血管网络的构建,明确这一组织工程实质脏器三维血管网络构建新方法的可行性。方法：利用64排CT采集正常人肝脏血管并转换成4cm×4cm血管断层平面坐标图,根据血管不同断面平面坐标图进行激光打孔处理。SEM检测打孔后,膜片变化。将打孔后的各膜片按次序通过基质胶粘贴在一起。以GFP-腺病毒标记骨髓干细胞诱导的内皮细胞,将标记的内皮细胞灌注于仿生血管网络中。放入37℃5%CO2培养箱培养,在培养的第3周检测血管形成状况。结果：激光打孔后,扫描电镜观察孔径边缘,孔径边缘光滑平整。经3周后免疫荧光检测,可见管壁形成内皮细胞层。结论：本研究针对组织工程脏器血管网络的构建,将为今后组织工程脏器构建奠定研究基础,有助于推动代谢功能性组织工程脏器的研究进展。
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R329

【参考文献】