广谱中和活性样本HIV-1膜蛋白基因的克隆和功能鉴定

发布时间：2020-03-09 16:18

【摘要】：[目的]从既往单采浆HIV-1慢性感染者中筛选有广谱中和活性的样本；克隆广谱中和活性样本的包膜蛋白基因并进行功能鉴定,分析获得的功能性env基因所制备的假病毒颗粒的中和特征,以构建适用于中和抗体评价用的假病毒颗粒；初步探讨广谱中和活性样本env基因的序列特征,分析特殊位点基因序列变异对毒株中和特性的影响,为进一步的广谱中和性单克隆抗体的分离、表位鉴定和疫苗免疫原设计提供参考信息。 [方法]本研究中应用代表A、B、C、B/C、A/E等不同亚型或流行重组型的25株假病毒通过假病毒单轮感染TZM-bl中和抗体分析技术,从我国既往单采浆HIV-1慢性感染者中筛选有广潜中和活性的样本。从广谱中和活性样本血浆提取病毒RNA,进行逆转录PCR扩增获得cDNA,再用巢式PCR扩增获得env基因。将env基因扩增产物回收纯化后克隆到pcDNATM3.1 D/V5-His-TOPO载体,转化后挑取菌落进行菌落PCR和酶切鉴定,并制备假病毒进行功能筛选,对功能性假病毒进行中和敏感性测定。初步分析广谱中和活性样本env基因的序列特征,包括V3区序列、可变区和恒定区序列、糖基化位点以及特殊位点基因序列变异对中和特性的影响,进行同源性比较并构建系统进化树。 [结果]通过假病毒单轮感染TZM-bl中和抗体分析技术筛选获得了3份具有广谱中和活性的样本(CBJC524、CBJC438、CBJV521)。这三份样本在体外中和实验中均能中和所用25个毒株的80%以上,其中对B亚型的中和宽度最大,对8个测试毒株都表现了不同程度的中和活性,对AE亚型病毒株的中和能力最弱,对其他亚型毒株的中和活性介于B亚型和AE亚型病毒株之间。本研究结果显示极少部分筛查样本能够产生广谱中和抗体活性,导致这些感染者产生广谱中和抗体的机制目前仍不清楚。通过功能筛选从3个样本(CBJC524、CBJC438、CBJV521)中各获得1个具有较高活性的质粒,构建的3个假病毒的半数组织感染量(TCID50)分别为781250、3906250、3906250 TCID50/ml。这：三个假病毒对自体血浆均表现一定的中和敏感性。三个假病毒均对4E10和和SCD4敏感。自感染者CBJC438制备的假病毒对IgGlbl2的中和敏感,中和50%病毒(IC50)的抗体浓度约为1.43μg/ml,另两个对此抗体的中和有抗性。自感染者CBJC524制备的假病毒对2G12的中和非常敏感,中和50%病毒(IC50)的抗体浓度约0.13μg/ml,另两个感染者制备的假病毒都对2G12的中和有抗性。自感染者CBJC438和CBJC521样本制符的假病毒对2F5的中和能力一般,IC50分别为13.05μg/ml、10.67μg/ml,感染者CBJC524制备的假病毒对2F5的中和有抗性。同源性比较及系统进化树分析结果表明这3份广谱中和样本扩增的HIV-1膜蛋白基因均属于B型。本研究结果也提示env基因的点突变和PNGSs的出现或位置改变可导致病毒的中和敏感性发生变化,与中和特征相关的突变散布于env基因中 [结论]应用假病毒单轮感染TZM-bl中和抗体测定方法筛选获得了3份含广谱中和活性的HIV-1感染样品。从3份含广谱中和活性HIV-1感染样品构建并各筛选出一株功能较强的env基因,通过假病毒对血浆样品或单克隆抗体中和敏感性分析,表明这3个假病毒可以用于中和抗体的评价和env基因生物学特征的研究。对广谱中和活性样本中env基因序列初步分析结果显示个体内病毒env序列具有高度同源性,gp120 V3区氨基酸高度保守,研究结果也提示env基因的点突变或糖基化位点的改变可能与中和敏感性相关。构建系列突变体对研究中观察到的基因序列变化与中和敏感性间的关系进行系统分析将有助于确定引起中和敏感性发生改变的序列特征。广谱中和活性HIV-1感染样品的获得和功能性膜蛋白基因的克隆鉴定为进一步分离广谱中和性单克隆抗体,深入研究其识别表位,以设计更有效的疫苗免疫原提供了基础。
【图文】：

图3.三个样本对不同亚型病毒的中和活性A:三个样本对HIV-IA亚型病毒株的中和活性B:三个样本对HIV-IB亚型病毒株的中和活性c:三个样本对HIV-IC亚型病毒株的中和活性Fig.3NeutraliZationactivitiesofthreesamPlestodistinetsubtyPevrius

2.3酉每切鉴定结果取转化克隆摇菌提取质粒，曰肠01和及m7HI图7所示，!沂得 :250bP gp16OJ浅l天I片段长为 3000bp，双酶切鉴定插入片段的大小，，如，JrU土期(}勺人小一致。朽OObp3。的bp图7重组质粒的酶[IJ分析 F19.7ReeorllbinantPlasrniddigestedby肋 01andBaznHlM:Marke DNALadde:Marker(_[到卜条带分别为4500、3000、2250、1500、1000、750、500、250)
【学位授予单位】：昆明医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R392

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