实时荧光PCR熔解曲线法快速鉴定嗜肺军团菌

发布时间：2020-03-11 05:33

【摘要】：目的： 建立特异、快速、敏感的实时荧光PCR熔解曲线基因分型方法,并探讨该法在临床痰标本和环境水样中鉴定嗜肺军团茵的应用价值。 方法： (1)根据嗜肺军团菌16S rRNA基因保守序列设计引物和淬灭FRET探针建立实时荧光PCR熔解曲线方法。 (2)优化引物与探针浓度,用嗜肺军团菌、非嗜肺军团菌及其他病原菌标准菌株验证该方法的特异性、敏感性和重复性,并做模拟实验。 (3)117份痰标本进行实时荧光PCR熔解曲线法鉴定,鉴定结果通过基因测序法检测结果验证。 (4)对18份环境水样进行培养,生化表型,普通PCR,实时荧光PCR熔解曲线鉴定,鉴定结果通过基因测序法检测结果验证。 结果： (1)引物序列：上游引物5'-AGGGTTGATAGGTTAAGAGC-3'.下游引物5'-CCAACAGCTAGTTGACATCG-3'。探针序列：锚定探针序列5'-CCCATACTCGAGTCAACC (FAM)-3',感应探针序列5'-(BHQ1) TATTATCTGACCGTCCCA G (ph)-3' (2)优化后的反应体系：10×PCR酶体系15.5μ1,上游引物(40.0pmol/μL)1.0μl,下游引物(2.0pmol/.μl)2.0μl,锚定探针(10pmol/μl)1.0μl,感应探针(10pmol/μl)0.5μl,模板5μ1。 优化后的反应程序：(Roche Lightcycler480实时荧光PCR仪)95℃3min:95℃10s,57℃20s,72℃30s,50个循环;熔解分析程序为95℃1min:40℃2min40℃升温至85℃,1℃/5s。FAM通道下检测荧光。 使用实时荧光PCR熔解曲线基因分型方法检测的15株嗜肺军团菌、30株非嗜肺军团茵、7株其他病原菌中,15株不同血清型的嗜肺军团菌Tm值均为57℃;7株非嗜肺军团菌Tm值为43℃,1株Tm值为45℃；其余22株非嗜肺军团菌和7株其他病原茵均无明显Tm值。该方法检测的灵敏度可达100fg/μl。 (3)117例痰标本经培养未发现嗜肺军团菌阳性。 117例痰标本中经实时荧光PCR熔解曲线基因法检测,发现有3例嗜肺军团茵,与基因测序法检测结果一致。 (4)环境水样经培养,得到可疑军团菌22株,经普通PCR鉴定,发现20株军团菌阳性。 环境水样经培养,22株可疑军团菌菌株经实时荧光PCR熔解曲线法鉴定嗜肺军团菌阳性的菌株共9株。与基因测序法检测结果一致。 环境水样直接提取DNA,普通PCR后军团菌阳性的标本：4号,5号,8号,9号,13号,14号.15号.16号,17号,18号,经基因测序法验证后,进一步显示5、9号标本为嗜肺军团菌,13、14、15号标本为辛辛那提军团菌,16、17、18号标本为长滩军团菌。 环境水样直接提取DNA、实时荧光PCR熔解曲线法鉴定嗜肺军团菌阳性标本：未发现阳性标本。 结论： (1)建立的实时荧光PCR熔解曲线法能够明确的对嗜肺军团菌鉴定,并可对部分军团菌进行分型。 (2)在对117例临床标本的鉴定中,检测出3例嗜肺军团菌,鉴定结果与PCR-基因测序方法一致。 (3)对环境水样检测过程中,通过采用分离培养、生化表型、实时荧光PCR熔解曲线法、基因测序方法的鉴定,发现环境水源能分离出军团菌,对分离菌株进一步的分型和鉴定,可采用实时荧光PCR熔解曲线法、基因测序方法。 (4)实时荧光PCR熔解曲线法除具有传统实时荧光PCR高灵敏、高特异性、高精确度及污染小等优点外，，淬灭探针荧光标记技术要求低,价格更便宜,耗时短,因此,该方法更适用于军团菌病的预防和临床诊断,尤其是在军团菌病暴发流行时,可提供快速的实验室诊断。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R378

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