Activin B通过JNK和ERK信号通路调节BMSCs促进皮肤伤口的愈合

发布时间：2020-03-14 02:32

【摘要】：皮肤创伤愈合是一个复杂的生物学过程,它启动一系列复杂的生物学事件,包括炎症、组织新生及组织重构[1]。虽然许多研究采用不同的方法治疗皮肤创伤修复,但愈合质量低、附属器官不可再生等依然是皮肤创伤愈合过程中的关键问题。目前,皮肤移植是修复大面积皮肤损伤的最有效方法。其中,应用骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem cells, BMSCs)治疗重症皮肤创伤展现出良好的应用前景。已有研究结果证实BMSCs在促进创面愈合方面起到积极的作用。Badiavas将骨髓间充质干细胞移植到深Ⅱ度烧伤创面,发现其明显促进创面的愈合[2]。付小兵等将BMSCs移植至猪深度烧伤创面,发现创面愈合速度明显加快,表皮增厚,真皮神经纤维增多,大大改善了创面愈合质量[3]。文献报道BMSCs还参与表皮、汗腺及创面血管的重建[4]。这些研究结果表明BMSCs是非常好的皮肤组织工程种子细胞。 创伤愈合的各个阶段都有生长因子的参与和调控,生长因子对治疗慢性难愈合皮肤创口和大面积烧伤创面有着广阔的应用前景[5]。活化素(Activin)是转化生长因子-β(transforming growth factor β, TGF β)超家族成员,成熟组织内,Activin信号可调节伤口愈合和表皮再上皮化,在皮肤创伤愈合过程中具有重要的作用[6]。而且Activin和其拮抗剂卵泡抑素(Follistatin)共同调节毛囊的发育和周期循环[7]。课题组前期研究发现Activin B在In vitro水平上通过JNK/MAPK信号通路促进角朊细胞的迁移,从而加速创伤修复过程[8,9，10]；近期研究显示：在In vivo水平上,Actvin B通过RhoA-JNK-cJun信号通路调节伤口愈合,并且在毛囊的再生和毛囊细胞的增殖方面起着关键的调控作用[11]。 干细胞从定居的部位进入到相应的组织器官内才能实现该部位的再生和修复,而细胞迁移的过程是受趋化因子、趋化因子受体系统所调控的[12,13]。在创伤愈合的过程中,Activin/TGF-β是趋化因子之一,可以通过不同的方式作用于炎症及修复细胞,调节细胞的趋化性迁移、增殖分化和细胞外基质合成与分泌[14]。研究发现BMSCs表面高度表达Activin受体,而且Activin/TGF-β通路下游信号分子Smad3的缺失导致BMSCs迁移能力降低[15.16,17],提示Activin/TGF-β信号可能在调控BMSCs的生物学功能上发挥重要作用。因此鉴于BMSCs能加速创伤愈合并促进皮肤血管及汗腺等组织的再生,而Activin B能促进BMSCs的迁移,我们假设Activin B可能改善了BMSCs介导的创伤修复,为了验证假设我们提出将Activin B和BMSCs联合起来,观察其治疗创伤愈合的作用,并在细胞水平上探索其可能的信号机制。本研究为临床治疗创伤修复提供了新的理论及实验依据。 (一)目的 探讨Activin B联合BMSCs对治疗大鼠皮肤创伤愈合的影响。 (二)方法 24只健康成年SPF级SD大鼠随机分为四个组：PBS对照组,BMSCs组,Activin B组和Activin B联合BMSCs组。10%水合氯醛(0.003ml/g)腹腔注射麻醉,SD大鼠背部两侧剪毛后用蜂蜜脱毛冻蜡脱毛,制作面积为1cm2正方形切口,深达皮下。术后动物自由进食、水。术后每天用细Mark笔将各组未愈合创面面积描记在透明薄膜上,利用数码相机在相同的条件下对描记下的图像拍照,IPP图像分析系统计算未愈合创面面积,计算创面愈合率,愈合率=(原始创面面积—未愈合的创面面积)/原始创面面积×100%。术后3d、7d、14d、21d取伤口周围0.5cm皮肤,PBS冲洗,4%多聚甲醛固定,PBS冲洗,乙醇逐级脱水,二甲苯透明,石蜡包埋。切片(5μm),二甲苯脱蜡,乙醇逐级复水,常规的苏木精伊红(hematoxylin and eosin, HE)染色。 (三)结果 与Activin B、BMSCs组及PBS组相比,ActivinB联合BMSCs组可以显著促进SD大鼠皮肤创面愈合,移植后第7d、14d,Activin B联合BMSCs组创面愈合率显著高于Activin B、BMSCs组及PBS组。移植后第12d,Activin B联合BMSCs处理组的12个创口(n=6)已完全闭合,而Activin B、BMSCs组及PBS组伤口尚未完全闭合。Activin B组和BMSCs组于移植后14d创面完全愈合,而PBS组创面完全闭合发生于第16d。第14d HE结果显示Activin B、BMSCs组及Activin B联合BMSCs处理组已经完成再上皮化,而且与PBS组和BMSCs组相比,Activin B组和Activin B联合BMSCs可以促进皮肤毛囊的再生,提示Activin B联合BMSCs不但可以促进急性创伤的愈合还可以促进伤口部位毛囊的再生。(四)结论 以上研究结果提示Activin B联合BMSCs能够促进大鼠皮肤创伤愈合。 (一)目的 在细胞(In vitro)水平及载体(In vivo)水平上探讨Activin B通过何种途径诱导BMSCs从而促进创伤愈合。 (二)方法 在细胞(In vitro)水平上利用免疫组化观察K15,K19的表达；利用细胞划痕实验、细胞趋化实验、细胞的Actin结构观察实验记录细胞迁移情况；在载体(In vivo)水平上利用Brdu标记观察创伤愈合过程中细胞增殖的变化。 (三)结果 1.K15,K19的表达：24孔板中放入coverglass,第4代BMSCs接种其中,每孔细胞含量约1×104个,分别用含5%胎牛血清的DMEM(PBS组)和5%胎牛血清+10ng/mlActivin B的DMEM (Activin B组)培养。从培养第一天起开始直到第21d,隔天一次,取出coverglass,进行细胞免疫化学检测。结果显示：PBS组和Activin B组相比,K15,K19的表达均未见显著性差异。 2. Brdu标记增殖细胞：进一步利用Brdu检测伤口周围组织细胞增殖发现：创伤后第7dBMSCs组、Activin B组与Activin B联合BMSCs组表皮基底层部位Brdu阳性细胞数增加与PBS组相比无显著差异。创伤后第14dBMSCs组、Activin B组和Activin B联合BMSCs组表皮基底层部位Brdu阳性细胞数增加分别与PBS组相比有显著差异,而BMSCs组、Activin B组和Activin B联合BMSCs组表皮基底层Brdu阳性细胞数增加两两相比均无显著差异。据此进一步认为Activin B并非通过调节BMSCs的增殖,从而促进皮肤创伤愈合。 3.细胞迁移实验结果显示：Activin B作用30min后,肌动蛋白纤维主要分布于细胞膜附近,2h时,肌动蛋白单体重组生成大量的肌动蛋白纤维铺满整个细胞并持续至4h,6h后大量肌动蛋白纤维解聚仅部分存在细胞膜附近,而PBS组细胞肌动蛋白纤维数量和分布没有变化,因此认为Activin B调节BMSCs肌动蛋白单体的聚合。细胞肌动蛋白的聚合在细胞迁移过程中起到关键作用,那么Activin B是否调节BMSCs的迁移呢?进一步用细胞划痕实验证明,划痕后72h,与PBS组相比,Activin B组细胞已经迁移至伤口,提示Activin B促进BMSCs向伤口部位迁移。继而利用Transwell进行细胞趋化迁移实验,结果发现与PBS组相比,Activin B组迁移至下室膜上细胞数明显高于PBS组,表明ActivinB诱导趋化BMSCs的迁移。上述结果提示Activin B通过调节肌动蛋白重组诱导BMSCs的趋化迁移促进伤口愈合。 (四)结论 Activin B主要通过诱导BMSCs的迁移,从而起到促进皮肤创伤愈合。 (一)目的 在细胞(In vitro)水平上探讨Activin B诱导BMSCs迁移的相关信号传导通路。 (二)方法 第四代BMSCs分别经JNK特异性抑制剂SP600125(5μmol)、p38特异性抑制剂SB202190(5pμmol)、ERK特异性抑制剂SL327(5μmol)处理细胞30min后,利用Phallotoxins染色观察Activin B诱导的BMSCs骨架蛋白的变化及划痕后细胞迁移情况。应用Western Blotting检测Activin B诱导的BMSCs p-JNK, p-ERK和p-p38的表达。 (三)结果 1. Phallotoxins染色：Activin B作用2h时,JNK特异性抑制剂SP600125和ERK特异性抑制剂SL327显著地抑制由Activin B诱导的肌动蛋白丝重组,而p38特异性抑制剂SB202190处理细胞,Activin B刺激2h后大量的肌动蛋白重组聚合并分布整个细胞。 2.细胞划痕实验结果：BMSCs经特异性JNK抑制剂SP600125及特异性ERK抑制剂SL327处理后发现：Activin B诱导的BMSCs迁移作用受到抑制,细胞划痕后72h,仅经过特异性p38抑制剂SB202190处理后的BMSCs创面有大量的迁移细胞,而PBS组,SP600125+Activin B组和SL327+Activin B组创面仅有较少的迁移细胞。 3. Western Blotting结果：Activin B作用于BMSCs后10min JNK和ERK迅速磷酸化至30min达到最高水平,2h时p-JNK恢复至基础水平,而2h时p-ERK磷酸化水平稍下降,但是p38磷酸化处于基础水平。 (四)结论 上述结果显示Activin B通过MAPK家族的JNK和ERK信号通路介导BMSCs肌动蛋白重组聚合和迁移。 (一)目的 探讨骨髓间充质干细胞联合生长因子对治疗皮肤创伤最为有效的移植途径。 (二)方法 将18只大鼠随机分为表皮移植组、尾静脉移植组和实验对照组。大鼠均建立全层皮肤缺损模型,手术后连续三天,用含有活化素(Activin B)(lOng/ml)的PBS重悬,继而用绿色荧光染料CFSE标记BMSC混悬液0.4mL,按照细胞数为1×106BMSC/天,分别通过表皮和尾静脉移植到全层皮肤缺损模型的大鼠中,对照组移植同等剂量的生理盐水。移植后3d、7d利用活体成像仪观察不同途径的移植情况,追踪观察到14d直到全皮愈合；用冰冻切片观察各组创面及不同脏器CFSE标记BMSCs移植的情况；并于3d、7d、14d记录大鼠皮肤创面面积、创面愈合率,不同时间点取组织标本制作石蜡切片,常规HE染色观察。 (三)结果 1.活体成像仪3d、7d观察实验组大鼠皮肤创面均有荧光显示,而对照组创面处无荧光显示。冰冻切片结果显示CFSE标记的BMSCs,创伤后第3dActivinB联合BMSCs表皮移植组已移植入创面处,Activin B联合BMSCs尾静脉移植组可以观察到向伤口迁移的趋势。创伤后第7dActivin B联合BMSCs表皮移植组伤口部位移植的BMSCs迁移至伤口边缘参与创伤的愈合,Activin B联合BMSCs尾静脉移植组在创伤边缘再上皮化部位也可见绿色荧光,对照组无。脏器冰冻切片结果显示：Activin B联合BMSCs表皮移植组和Activin B联合BMSCs尾静脉移植组肺脏绿色荧光表达最强,肾脏也见少量绿色荧光表达而心脏、肝脏未见绿色荧光,PBS组均未见绿色荧光。 2.术后第7d、14dBMSCs移植组创面愈合率均高于对照组(P0.05),而表皮移植组与尾静脉移植组相比无统计学意义。第14d HE结果显示ActivinB联合BMSCs表皮注射组及Activin B联合BMSCs尾静脉注射组均已经完成再上皮化,而且与PBS组相比,Activin B联合BMSCs表皮注射组及Activin B联合BMSCs尾静脉注射组可以促进皮肤毛囊的再生。 (四)结论 Activin B联合BMSCs经局部移植和尾静脉移植均可以迁移至皮肤创伤部位并参与皮肤创伤的修复,相对于尾静脉移植,局部移植在创伤修复中更简便易行。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R363

【参考文献】

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1 谢江;李廷玉;曾丽玲;钟耀华;郭川;向德兵;陈小章;;骨髓间充质干细胞促进大鼠皮肤创面愈合的作用及机制研究[J];第三军医大学学报;2006年23期

2 龙剑虹;刘芳芬;祁敏;;体外诱导骨髓间充质干细胞分化为表皮干细胞[J];中南大学学报(医学版);2006年06期

3 何丽娟;南雪;王韫芳;管利东;白慈贤;施双双;袁红丰;陈琳;刘大庆;裴雪涛;;自体骨髓间充质干细胞为种子细胞构建组织工程化全层皮肤[J];中国科学(C辑:生命科学);2007年03期

4 孙晓艳;范洪学;;骨髓间充质干细胞的研究进展[J];吉林医学;2007年02期

5 李庆林;肖能坎;张琳;;探讨活化素B在皮肤创伤愈合中的作用[J];热带医学杂志;2008年06期

6 买霞;陈莉;扎拉嘎胡;战丽艳;徐瑞成;;大鼠骨髓间充质干细胞分离培养及其生物学特性观察[J];中国组织工程研究与临床康复;2007年03期

7 易成刚;郭树忠;张琳西;;干细胞研究进展及在整形美容外科的应用前景[J];中华医学美学美容杂志;2006年03期

8 傅文玉,路艳蒙,朴英杰;人骨髓间充质干细胞的培养及多能性研究[J];中华血液学杂志;2002年04期

9 黄莉明;张娇;章庆国;;5-BrdU标记的骨髓间充质干细胞对大鼠创面愈合的作用研究[J];组织工程与重建外科杂志;2008年01期

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本文编号：2586887