环二腺苷酸（c-di-AMP）为基础的重组BCG疫苗的生物学及免疫学特性研究

发布时间：2020-04-03 11:15

【摘要】：背景结核病(Tuberculosis,TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)引起的、经呼吸道传播的慢性传染病。TB是目前全球造成死亡人数最多的传染病。TB惟一批准使用的疫苗是卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin,BCG),可有效预防儿童TB,但是对成人TB保护效果不理想。在BCG中表达Mtb免疫优势抗原,以提高BCG免疫效率,是新型TB疫苗研究的重要方向。但是,目前仍没有获得能够替代BCG的重组BCG(recombinant BCG,rBCG)疫苗。因此,应当积极探索新的疫苗构建方式,以获得保护效果和安全性均优于BCG的rBCG。环二腺苷酸(cyclic di-adenosine monophosphate,c-di-AMP)是细菌第二信号分子,不仅参与调节细菌多种生理过程,还可诱导固有免疫应答、黏膜免疫应答及特异的适应性免疫应答。国外包括课题组前期研究发现,过表达c-di-AMP合成酶DisA、或敲除c-di-AMP分解酶的重组Mtb c-di-AMP水平均升高,能够激活I型干扰素应答,并诱导宿主细胞自噬;c-di-AMP水平升高降低了重组Mtb的毒力,促进了宿主对Mtb的清除。c-di-AMP被认为是一种新型的病原体相关的分子模式(pathogen associated molecular pattern,PAMP)。因此,c-di-AMP成为细菌疫苗研究的靶点。目的构建过表达Mtb c-di-AMP合成酶DisA的rBCG并研究其生物学特性;初步明确该rBCG对巨噬细胞自噬的调节作用,明确该rBCG的免疫学特性并评价其对Mtb感染小鼠的免疫保护效率。方法和结果1.rBCG-DisA的构建及其生物学特性研究以Mtb H37Rv基因组为模板,PCR扩增1 100bp的Rv3586(disA)基因片段;亚克隆至大肠埃希菌-分枝杆菌过表达载体PW54,构建包含disA基因的重组质粒,命名为PW56。将PW56质粒电转化至BCG感受态细胞,PCR和Western blot鉴定重组菌,结果表明在BCG中成功表达43kDa的DisA,该重组菌株命名为rBCG-DisA。制备菌株核苷酸样品,HPLC检测结果显示,rBCG-DisA的c-di-AMP水平显著升高(P0.05)。对BCG生物学特性研究表明,c-di-AMP水平升高不影响BCG的生长速度。齐-尼抗酸染色结果表明过表达DisA不影响BCG抗酸特性及菌体排列。透射电镜观察及分析结果表明,c-di-AMP水平升高使BCG菌体长度变短20.4%。2.rBCG-DisA对巨噬细胞自噬的调节作用研究化学合成的c-di-AMP(10μg/mL)作用于RAW264.7巨噬细胞,提取细胞总RNA,检测自噬相关基因转录水平。qRT-PCR结果显示,c-di-AMP可诱导自噬相关基因LC3、Beclin1、Atg5及Atg7转录水平显著上调(P0.01,P0.05,P0.05,P0.01)。BCG、rBCG-DisA感染RAW264.7巨噬细胞(MOI=10),自噬相关基因转录水平也上调,其中rBCG-DisA感染诱导Beclin1、Atg7表达上调更为显著(P0.01,P0.05)。Western blot结果显示,BCG、rBCG-DisA感染RAW264.7巨噬细胞均不影响LC3、p62蛋白表达水平;BCG、rBCG-DisA感染小鼠腹腔巨噬细胞不影响LC3蛋白表达,但p62蛋白表达均显著增加(P0.01,P0.01)。3.rBCG-DisA的免疫学特性研究将雌性BALB/c小鼠随机分为4组:Na?ve、UN、BCG、rBCG-DisA组。对照组Na?ve和UN组分别皮下接种0.1mL PBS,免疫组BCG和rBCG-DisA组分别皮下接种细菌1×10~6CFU/只。每天观察免疫小鼠饮水、进食情况,每周称量小鼠体重,结果表明BCG、rBCG-DisA免疫小鼠与对照组小鼠进食和饮水无差异,各组小鼠体重均呈上升趋势,两免疫组间小鼠体重无显著差异(P0.05)。免疫完成后4w,ELISA检测免疫小鼠血清中特异性抗体水平,结果表明两免疫组小鼠抗体水平均显著升高(P0.05)。MTS检测脾淋巴细胞增殖情况,结果显示BCG菌体蛋白刺激后,两免疫组淋巴细胞增殖显著(P0.05,P0.05),DisA蛋白刺激后,rBCG-DisA组增殖更为显著(P0.001)。流式细胞术检测CD4~+、CD8~+T细胞比例,结果显示两免疫组小鼠CD4~+和CD8~+T细胞的百分比、CD4~+/CD8~+比值与对照组小鼠相比无显著变化(P0.05)。qRT-PCR检测免疫小鼠肺脏、脾脏细胞因子转录水平,结果显示两免疫组小鼠脾脏、肺脏IFN-γ、IL-2和IL-10转录水平均显著上升,rBCG-DisA组三种细胞因子升高更为显著(P0.05),且rBCG-DisA组诱导的IFN-γ水平显著高于BCG免疫组(P0.05)。ELISA检测脾淋巴细胞细胞因子分泌,结果显示两免疫组脾淋巴细胞IFN-γ、IL-2、IL-10分泌均增加,其中rBCG-DisA组IFN-γ分泌增加更为显著(P0.01)。流式细胞术检测胞内细胞因子表达,结果显示rBCG-DisA组仅分泌TNF-α的CD4~+T细胞比例显著增加(P0.05)。免疫完成后4w,小鼠尾静脉感染Mtb H37Ra 5×10~4CFU/只。免疫小鼠经Mtb感染后8w,检测体液和细胞免疫应答水平。结果表明,两免疫组小鼠Mtb感染后,体内抗体水平进一步升高,其中rBCG-DisA组显著升高(P0.05);淋巴细胞增殖显著(P0.01,P0.01);IFN-γ、IL-2、IL-10的转录水平均升高,且rBCG-DisA组与BCG组相比显著升高(P0.01,P0.05,P0.05);rBCG-DisA免疫组Th1型和Th2型的细胞因子分泌均显著增加,且IFN-γ、IL-2、IL-10分泌显著高于BCG组(P0.01,P0.05,P0.05)。HE染色结果显示,rBCG-DisA免疫组小鼠肺组织病理改变与BCG免疫组小鼠相似。平板计数法检测感染小鼠肺脏、脾脏荷菌数,结果发现与未免疫感染组(UN组)相比,两免疫组小鼠肺脏、脾脏荷菌数均显著降低(P0.01),两免疫组间小鼠脏器荷菌数无显著差异(P0.05)。结论本研究成功构建了c-di-AMP水平升高的rBCG-DisA,证明c-di-AMP水平影响菌体长度;c-di-AMP、rBCG-DisA可显著诱导自噬相关基因表达,且rBCG-DisA使自噬降解减少。rBCG-DisA免疫小鼠可诱导体液免疫应答,及以IFN-γ表达升高为特征的Th1型细胞免疫应答。两免疫组小鼠经Mtb感染后,Th1和Th2细胞免疫应答水平均上升,其中rBCG-DisA免疫组显著高于BCG组;rBCG-DisA免疫小鼠对Mtb感染具有保护作用,其保护作用和BCG免疫相当。
【图文】：

图 1 已批准进入临床试验的 TB 疫苗[14]Figure 1 TB vaccines approved for clinical trialsMVA85A（ID/IM/Aerosol），为重组痘病毒 MVA85A（recombinant pox virus MVA85A）表达 Ag85A 的病毒载体疫苗，用于初次免疫、加强免疫，或者感染后免疫治疗[15]。③TB/FLU-04L，为表达 Mtb 抗原Ag85A、早期分泌 6kDa靶抗原（early secreted antigentarget 6kDa，ESAT-6）的流感病毒载体（influenza virus vector）疫苗，该疫苗可表达抗原，但存在复制缺陷，不能在哺乳动物体内复制[16]。（2） 亚单位疫苗 4 种：①H4:IC31，是 Ag85B、TB10.4 融合蛋白加入 IC31 佐剂组成的亚单位疫苗[17]。②H56:IC31 是由 Mtb 多阶段抗原组成的亚单位疫苗，包括Mtb 早期抗原 Ag85B、ESAT-6 和潜伏感染抗原 Rv2660c 组成的融合蛋白，，再加入 IC31佐剂，用于初次免疫或者加强免疫[18]。③ID93+GLA-SE，包括 Mtb 四种抗原，分别是毒力因子 Rv2608、Rv3619、Rv3620 和潜伏感染相关因子 Rv1813，再加入 GLA-SE

菌、化脓性链球菌等致病菌中也都发现了 c-di-AMP 合成酶。随后，在枯中发现了第一个 c-di-AMP 分解酶 YybT，其具有磷酸二酯酶（phosphodies）活性，可将 c-di-AMP 水解生成线性 pApA 分子。YybT 含有有磷酸二甘氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-苯丙氨酸（Gly-Gly-Asp-Glu-Phe，GGDE，将其与其他菌属中的含有 GGDEF 结构域的蛋白命名为 GGDEF 结构（GGDEF domain protein containing PDE，GdpP）[61]。本室柏银兰等[8]首次报道 Rv3586 是 Mtb 中合成 c-di-AMP 的 DAC 酶，其与 DisA 相似。通过分析 Mtb 的基因组，发现 Rv3586 是 Mtb 中惟一的 c-d酶。2014 年，又首次报道，Rv2837c 是 Mtb 中 c-di-AMP 的分解酶，且含-组氨酸-组氨酸（Asp-His-His，DHH）结构域对 CnpB 酶催化 c-di-AMP 不可少，将其命名为 CnpB（cyclic nucleotide phosphodiesterase，CnpB）[62di-AMP 水平受合成酶 Rv3586 和分解酶 Rv2837c 的精密调控，如图 2 所
【学位授予单位】：中国人民解放军空军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R392

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本文编号：2613300