“沪191”麻疹病毒疫苗株反向遗传学系统的建立及mRNA甲基转移酶缺陷麻疹病毒疫苗株研发

发布时间：2020-04-10 10:16

【摘要】：麻疹(Measles)是由麻疹病毒(Measles virus,MV)引起的严重威胁公众健康的急性传染病,其传染性强,在人口密集而未接种疫苗的地区易于流行。麻疹尚无特异治疗药物,预防麻疹感染关键在于接种麻疹疫苗。麻疹疫苗在我国广泛使用后,大大降低麻疹在人群中的发病率,中国麻疹疫情得到了很好的控制。但2005年以后我国麻疹疫情出现大幅度回升。国内研究发现,麻疹重新流行的主要原因主要为以下三点:一是偏远地区儿童疫苗接种率低;二是现有疫苗免疫持久性达不到终身免疫,大龄儿童体内麻疹抗体水平衰减;三是与疫苗株相比,麻疹病毒流行株在基因组已经发生了不少突变,特别是与麻疹病毒抗体产生有关的N、H两个基因差异明显,可能对疫苗株免疫效果产生了一定的影响。且现有“沪191”麻疹病毒疫苗株仍会引起一些温和的一定副反应,所以研发免疫持久力更好、安全性更优的新型麻疹疫苗越发显得迫切。运用反向遗传学技术,建立麻疹病毒的反向遗传学系统对麻疹病毒基因组进行相应的突变、缺失或插入,从而获得安全性更高,免疫能力更好的新型麻疹病毒疫苗株,是目前国内外研究的热点,也是开发新型麻疹减毒疫苗的最佳研究手段。麻疹病毒属于副粘病毒科(Paramyxoviridae),麻疹病毒属(Morbillivirus),为单股负链RNA病毒。运用反向遗传学技术,将病毒全长基因组克隆和辅助质粒共转染于哺乳动物细胞可在体外重新拯救出麻疹病毒。本研究构建了“沪191”麻疹病毒疫苗株的全长基因组cDNA克隆,构建了能够表达麻疹病毒N、P、L蛋白的3个辅助质粒,全长质粒和辅助质粒共转染于BHK-SR19-T7细胞后,成功拯救出“沪191”麻疹病毒疫苗株(rMV-Hu191),代表“沪191”麻疹病毒疫苗株的反向遗传学系统构建成功。与宿主细胞相似,病毒mRNA加工对病毒基因组的复制和病毒蛋白表达起着至关重要的作用。单股负链RNA病毒的mRNA后期需要通过加帽、甲基化、聚腺苷酸化等一系列修饰,其中病毒mRNA的加帽、甲基化对病毒mRNA的稳定、翻译最为重要。与宿主细胞不同的是病毒mRNA的加帽、甲基化过程中所需的一系列酶催化反应均由病毒的L蛋白完成,破坏病毒L蛋白mRNA甲基转移酶的功能能够抑制病毒mRNA帽子结构的甲基化,使病毒毒力减弱。病毒L蛋白mRNA甲基转移酶拥有一个催化活性位点和与S-腺苷甲硫氨酸(SAM)结合位点,在帽结构甲基化过程中S-腺苷甲硫氨酸为L蛋白甲基转移酶甲基供体。本研究我们对“沪191”麻疹病毒疫苗株L蛋白mRNA甲基转移酶的S-腺苷甲硫氨酸结合位点保守区域进行定点突变,构建了 3个mRNA甲基转移酶缺陷的“沪191”麻疹病毒疫苗株全长基因组质粒突变体pMV-Hu191-G1788A,pMV-Hu191-G1790A,pMV-Hu191-G1792A,基于成功构建的麻疹病毒“沪191”疫苗株的反向遗传学系统,拯救出2株mRNA甲基转移酶缺陷麻疹病毒疫苗株rMV-Hu191-G1788A,rMV-Hu191-G1792A。在体外实验中:rMV-Hu191-G1788A,rMV-Hu191-G1792A形成的噬斑明显小于 rMV-Hu191,rMV-Hu191-G1788A,rMV-Hu191-G1792A 在 Vero 细胞上出现CPE的时间,病毒达到最高滴度的时间要晚于rMV-Hu191。rMV-Hu191-G1788A,rMV-Hu191-G1792A表现为致弱或中度致弱,在细胞上连续传代时,rMV-Hu191-G1788A,rMV-Hu191-G1792A能够保持良好的稳定性。动物实验研究结果显示:一、棉鼠肺内rMV-Hu191-G1788A、rMV-Hu191-G1792A滴度低于 rMV-Hu191;rMV-Hu191-G1788A、rMV-Hu191-G1792A 对棉鼠肺组织造成的损伤弱于 rMV-Hu191。二、rMV-Hu191-G1788A、rMV-Hu191-G1788A 在棉鼠体内遗传稳定性良好。三、rMV-Hu191-G1788A、rMV-Hu191-G1788A能够保护棉鼠不受高滴度麻疹病毒攻毒感染。四、rMV-Hu191-G1788A,rMV-Hu191-G1792A两株mRNA甲基转移酶缺陷麻疹病毒疫苗株免疫持久性要优于rMV-Hu191。研究结果表明通过抑制病毒L蛋白mRNA甲基转移酶活性来获得麻疹病毒减毒的策略可行,同时rMV-Hu191-G1788A、rMV-Hu191-G1788A可作为两株理想的疫苗候选株。“沪191”麻疹病毒疫苗株的反向遗传学系统的成功建立,为今后研究麻疹病毒致病机制,基因结构、遗传变异等方面奠定了坚实的基础;也为研发新型麻疹疫苗、麻疹载体疫苗提供了提供了强大的技术平台。mRNA甲基转移酶缺陷麻疹病毒疫苗株的研发成功则为今后研发新型麻疹疫苗开发提供了新方向,副粘病毒mRNA甲基转移酶所在的区域非常保守,破坏麻疹病毒mRNA甲基转移酶致弱麻疹病毒的策略也可用于其他副粘病毒疫苗的研制开发。
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使用邋ＧｅｎｅＡｒｔ？邋Ｈｉｇｈ－Ｏｒｄｅｒ邋Ｇｅｎｅｔｉｃ邋Ａｓｓｅｍｂｌｙ邋Ｓｙｓｔｅｍ邋试剂盒将涵盖沪“１９１”麻逡逑疹病毒疫苗株全基因组序列的Ｎ、Ｐ、Ｍ１、Ｍ２、Ｆ、Ｈ、Ｌｌ、Ｌ２等８个片段一次逡逑性连到ｐＹＥＳ－２改造在载体中。构建示意图如图１－３所示。具体步骤如下：逡逑１逦！佭逦＇ｉ邋概：逦Ｉ邋歘逦Ｕｍｉ逦Ｉｔｉｓｓｅ逡逑ｐＥＡＳＹ－Ｎ邋ＰＥＡＳＹ．Ｐ邋Ｐ￡ＡＳＹ＇Ｍ２邋ｐＥＡＳＹ－Ｆ」璧舰邋ｐＥＡＳＹ＾．１逦ｐ￡ＡＳＹ＾＾？逡逑ｍｓｍｅｍｍｓｍｅ逦ｍｍｔｍｓｍｉｗｉＸ逦ａｍｍｍｍｉｍｔｓｍｘｓｍｉｍｓｍ逡逑ｐＥＡ￥Ｙ＾１逦Ａ逡逑＇逦．．．．．逦■■逦－逦？逦—逦￣Ｔ７邋ｐｒｏｍｏｔｅｒ逡逑３ＮＣＴ邋ｔ邋５ＮＣＴ邋１邋ｈ邋Ｈ＾ｋ逦１７逡逑，丁７逦＼％逦ｉ邋Ｉ邋＝ｒｖｏｎｃｏｄｉｎｇ邋ｔｅｍｔｉｎａＵｅｇｉｏｎｓ逡逑＼逦Ｊ逦［邋５ＮＣＴ邋；邋＝ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ邋ｔｅｒｍｉｎａｌ邋ｒｅｇｒｏｎｓ逡逑ｐ
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R392

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

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本文编号：2622104