抗人CD25基因工程抗体和免疫毒素在毕赤酵母中的表达

发布时间：2017-03-22 23:00

  本文关键词：抗人CD25基因工程抗体和免疫毒素在毕赤酵母中的表达，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的和意义CD25表达于活化T细胞表面,静息T细胞不表达,这为靶向治疗以活化T细胞介导的疾病如T细胞淋巴瘤、自身免疫病、移植排斥反应等提供了科学依据。采用毕赤酵母表达系统,以Daclizumab(人源化抗CD25单抗隆抗体)为基础,构建重组表达载体pPICZalpha A-biscfv (Daclizumab)和pPICZalpha A-dmDT390-biscfv (Daclizumab),在重组毕赤酵母GS115菌株中诱导表达biscfv (Daclizumab)和dmDT390-biscfv (Daclizumab)重组蛋白,为淋巴瘤、急性排斥反应、自身免疫病等疾病提供新的药物治疗方案。研究方法合成目的基因及构建表达载体：利用DNAWorks软件,获得具有互补末端的寡核苷酸引物,采用装配PCR法,合成四条短的基因片段scfv (1)、scfv (2)、scfv (3)、 dmDT390并连接至pMD19-T载体,测序正确后,四条短的基因片段酶切拼接后最终连入毕赤酵母表达载体pPICZalpha A。采用毕赤酵母系统表达蛋白：线性化的表达载体通过氯化锂转化方法转至毕赤酵母GS1 15,在含有博来霉素的YPDS平板中筛选阳性克隆子。采用BMGY培养基增殖培养,BMMY培养基诱导蛋白表达。SDS-PAGE和Western blot:蛋白样品经SDS-PAGE电泳后转至PVDF膜上,采用鼠抗组氨酸尾抗体作为一抗,辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体作为二抗,采用化学发光试剂盒观察结果。蛋白纯化：采用镍柱纯化蛋白,纯化出的蛋白采用高效液相色谱仪(HPLC)进行分析。结果1.通过DNAWorks软件设计出合成scfv (1)、scfv (2)、scfv (3)的24条寡核苷酸引物,以及合成dmDT390的44条寡核苷酸引物,通过装配PCR将合成的基因片段连入pMD19-T载体,测序获得插入正确基因片段的pMD19-scfv(1)、pMD19-scfv (2)、pMD19-scfv (3) 和 pMD19-dmDT390载体。pMD19-scfv (1)和pMD19-scfv(2)经酶切拼接后最终连入pPICZalpha A载体形成了pPICZalpha A-biscfv表达载体；pMD 19-scfv(2)、pMD 19-scfv(3)和pMD19-dmDT390经酶切拼接后最终连入pPICZalphaA载体形成了pPICZalpha A-dmDT390-biscfv表达载体。2.经氯化锂转化法获得了稳定整合目的基因的毕赤酵母菌株。3.整合了biscfv目的基因的毕赤酵母菌,表达产物经SDS-PAGE(还原性)电泳分析,得到分子量约为55kd表达产物,western blot验证含组氨酸尾,为目的蛋白。4.整合了dmDT390-biscfv目的基因的毕赤酵母菌,表达产物经SDS-PAGE(非还原性)电泳分析,得到分子量约为95kd表达产物,western blot验证含组氨酸尾,为目的蛋白。5.经镍柱纯化的蛋白经高效液相色谱仪检测纯度大于99%。结论重组毕赤酵母GS115能稳定表达biscfv和dmDT390-biscfv蛋白,蛋白经镍柱纯化后能获得高纯度的蛋白。
【关键词】：毕赤酵母 CD25 达利珠单抗 biscfv 白喉毒素
【学位授予单位】：福建中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392;Q78
【目录】：

• 中文摘要6-8
• Abstract8-10
• 前言10-12
• 第一章 材料和方法12-23
• 1 材料12-14
• 1.1 PCR引物,菌株,质粒12
• 1.2 培养基12-13
• 1.3 试剂与溶液配制13-14
• 1.4 主要设备14
• 2 方法14-23
• 2.1 目的基因的合成及表达载体的构建14-19
• 2.2 采用毕赤酵母体系表达biscfv和dmDT390-biscfv重组蛋白19-21
• 2.3 biscfv和dmDT390-biscfv蛋白纯化21-23
• 第二章 实验结果23-27
• 1 目的基因的合成和表达载体的构建23-24
• 1.1 目的基因的合成23-24
• 1.2 表达载体的构建24
• 2 采用毕赤酵母体系表达biscfv和dmDT390-biscfv重组蛋白24-26
• 2.1 biscfv蛋白24-25
• 2.2 dmDT390-biscfv蛋白25-26
• 3 蛋白纯化26-27
• 3.1 biscfv蛋白纯化26
• 3.2 dmDT390-biscfv蛋白纯化26-27
• 第三章 讨论27-30
• 1 目的基因合成及表达载体的构建27-28
• 1.1 装配PCR法27-28
• 1.2 构建表达载体28
• 2 毕赤酵母体系表达biscfv和dmDT390-biscfv蛋白28-29
• 2.1 质粒线性化28
• 2.2 蛋白表达28
• 2.3 SDS-PAGE和Western blot28-29
• 3 蛋白纯化29-30
• 3.1 硫酸铵沉淀29
• 3.2 透析29
• 3.3 镍柱纯化29
• 3.4 超滤29-30
• 结论30-31
• 参考文献31-33
• 附录33-38
• 致谢38-39
• 文献综述39-46
• 参考文献44-46
• 作者简历46

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 高新;宋海峰;林殿海;杨小盼;万德友;陈枢青;;人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-免疫球蛋白G1 Fc融合蛋白在糖基工程化毕赤酵母中的表达[J];军事医学;2012年11期

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本文编号：262360