siRNA沉默Bmi-1基因表达对K562细胞自噬的影响

发布时间：2017-03-23 01:06

  本文关键词：siRNA沉默Bmi-1基因表达对K562细胞自噬的影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:自噬是一种溶酶体的降解途径,它广泛存在于真核生物细胞内。一般情况下适度的自噬水平可以维持正常细胞的自我稳态,但是过高水平的自噬可引起细胞内环境的代谢紊乱而导致细胞内发生自噬性死亡。Bmi-1(B-cell-specific Moloney murine leukemia virus insertion site 1)基因是多梳基因(Polycomb Group genes,PcG)家族的重要成员之一。目前研究发现,Bmi-1基因可参与到干细胞的增殖、分化以及衰老等过程,在很多种肿瘤的发生发展中起到了非常重要的作用。本实验拟选取慢性髓细胞白血病K562细胞作为研究对象,来探讨Bmi-1基因是否参与K562细胞株的自噬情况以及其可能的分子机制。方法:1、本实验选用慢性髓细胞白血病K562细胞作为研究对象。2、依照本实验室前期已设计好的五种siRNA质粒序列:pGenesil-2-HK(阴性对照质粒),pGenesil-2-Bmi-11,pGenesil-2-Bmi-12,pGenesil-2-Bmi-13和pGenesil-2-Bmi-14序列经小干扰siRNA方法分别转染K562细胞,得到六种细胞:将未转染的细胞称为K562-W,将转染阴性对照质粒细胞称作K562-V,将转染干扰质粒的细胞依次称为K562-S1,K562-S2,K562-S3,K562-S4。3、Western blot和RT-PCR实验方法检测不同的干扰质粒转染K562细胞后Bmi-1蛋白和mRNA的表达情况。4、采用MTT实验方法检测不同的质粒转染K562细胞后在不同作用时间下对K562细胞增殖的影响。5、采用透射电镜扫描的方法检测不同的质粒转染K562细胞前后细胞自噬的发生情况。6、采用western blot实验方法检测不同的质粒转染K562细胞前后细胞中各种蛋白质包括:Beclin1、LC3、Akt、p-Akt、mTOR、PTEN的表达情况。结果:1、RT-PCR和western blot实验结果显示经转染后的K562-S1与K562-S3细胞明显的抑制了Bmi-1的表达,而K562-S2与K562-S4细胞抑制Bmi-1的表达效果不如K562-S1与K562-S3细胞明显,所以我们选用K562-S1和K562-S3细胞以及K562-W和K562-V细胞进行后续实验。2、MTT结果显示经不同质粒转染后的K562-S1和K562-S3细胞与K562-W和K562-V细胞相比生长速度明显受到抑制(P0.05),而K562-W和K562-V细胞之间无显著性差异(P0.05)。3、透射电镜扫描观察细胞内自噬情况显示K562-S1和K562-S3细胞存在自噬小体,而K562-W和K562-V细胞未发现自噬小体。4、Western blot实验结果显示,当小干扰siRNA沉默Bmi-1基因后,自噬特异性蛋白Beclin1和LC3-II的表达增加,而p-Akt和mTOR的表达下降,且PTEN蛋白的表达增加。若在K562细胞中加入3-MA培养2h后再进行转染,则转染后的K562-S1细胞中自噬特异性蛋白Beclin1和LC3-II的表达比未加3-MA转染的细胞明显下降,并且加3-MA后转染的K562-V细胞Beclin1和LC3-II的表达与未加3-MA的K562-V细胞相比无变化。而在转染干扰质粒的同时加入mTOR抑制剂雷帕霉素(Rapamycin)后,mTOR的表达相对减少,且自噬特异性蛋白Beclin1和LC3-II的表达相对增加。并且加3-MA后转染的K562-V细胞mTOR的表达也相对减少,且自噬特异性蛋白Beclin1和LC3-II的表达也相对增加。结论:沉默Bmi-1基因的表达后会导致K562细胞发生自噬,其机制可能是Bmi-1-siRNA通过调控PTEN/Akt/mTOR通路实现的。
【关键词】：Bmi-1基因 siRNA 自噬 白血病
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R363
【目录】：

• 中文摘要6-8
• 英文摘要8-10
• 前言10-11
• 材料和方法11-20
• 结果20-24
• 讨论24-28
• 结论28-29
• 参考文献29-33
• 综述33-43
• 参考文献39-43
• 致谢43-44

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